p62、p16和Ki-67在乳腺癌中的表達及臨床意義

周成美 程新宇

(1錦州醫(yī)科大學(xué)第三臨床學(xué)院2015級本科生，遼寧 錦州 110032；2沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院病理科)

研究發(fā)現(xiàn)〔1〕乳腺癌的發(fā)生是多因素共同參與、多個分化階段及多基因表達水平異常的復(fù)雜過程。自噬可清除受損的細胞器抑制腫瘤形成，而自噬缺陷可以導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，自噬相關(guān)蛋白p62由C-Myc編碼，在細胞質(zhì)中合成定位于細胞核的一種多功能泛素化結(jié)合蛋白〔2〕，具有選擇性自噬功能在一定程度上反映了自噬活性〔3〕。抑癌基因p16是細胞周期調(diào)控因子，其失活及突變與多種腫瘤發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)。增殖指數(shù)(Ki-67)是細胞增殖的重要標志，常可作為預(yù)測惡性腫瘤發(fā)展及預(yù)后的指標。本文主要應(yīng)用免疫組織化學(xué)SP法檢測乳腺癌及癌旁正常乳腺組織及乳腺良性腫瘤中p62、p16和Ki-67表達差異，探討三者與患者臨床病理特征的關(guān)系，為乳腺癌治療及預(yù)后提供新的研究靶點。

1 材料與方法

1.1標本來源 選取2016年1月至2017年12月沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院病理科79例乳腺癌標本(乳腺癌組)和20例相應(yīng)距腫瘤組織5 cm以上的癌旁正常乳腺組織及乳腺良性腫瘤標本(對照組)。乳腺癌組中三陰乳腺癌39例，非三陰乳腺癌40例。所有患者臨床病理資料存檔完整。患者年齡30～78歲，中位年齡58歲；腫瘤直徑≤2 cm 26例，腫瘤直徑>2 cm 53例；組織學(xué)分級Ⅰ級2例，Ⅱ級54例，Ⅲ級23例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移33例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移46例。患者經(jīng)免疫組織化學(xué)檢測時均未經(jīng)放化療。

1.2主要試劑 通用型p62鼠抗人單克隆抗體購自美國Abcam 公司；p16、Ki-67、雌激素受體(ER)和SP試劑盒及二氨基聯(lián)苯胺(DAB)均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.3免疫組織化學(xué)SP法染色 乳腺癌患者腫物切除后均使用10%的中性甲醛固定，依據(jù)病理規(guī)定規(guī)范取材，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，常規(guī)石蠟脫水，抗原高壓修復(fù)，室溫冷卻30 min；每張切片均按照免疫組化SP法操作流程制作，DAB顯色，鏡下觀察后自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，磷酸鹽緩沖液(PBS)或自來水沖洗返藍，梯度酒精脫水，二甲苯透明后，中性樹膠封固。使用PBS代替一抗作陰性對照，用已知陽性乳腺癌標本切片作陽性對照。

1.4結(jié)果判讀 免疫組化切片均由兩位經(jīng)驗豐富的病理科醫(yī)師采用雙盲法單獨判讀。p62 陽性結(jié)果判讀標準：p62陽性表達為出現(xiàn)棕黃色顆粒定位于細胞質(zhì)。p16陽性判斷標準：陽性表達定位于細胞質(zhì)。Ki-67陽性判斷標準：陽性表達定位于細胞核。在高倍鏡下任意計數(shù)5個視野，每次選取200個細胞進行觀察，按陽性細胞所占百分比計分，評分標準為〔4〕:0分為無陽性細胞；1分為陽性細胞<10%；2分為陽性細胞10%～30%；3分為陽性細胞>30%。按染色強度計分：不著色為0分；淡黃色計1分；黃色計2分；棕黃色計3分。陽性細胞百分比計分與染色強度計分的乘積:0～2分為陰性，3～9分為陽性。ER陽性結(jié)果判斷標準：ER陽性表達定位于細胞核。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS17.0軟件進行χ2檢驗、Pearson相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1p62、p16和Ki-67在乳腺組織中表達 乳腺癌組p62陽性表達位于細胞質(zhì)，呈棕黃色(圖1、2)，三陰乳腺癌陽性表達率為69.2%(27/39)、非三陰乳腺癌陽性表達率為47.5%(19/40)，乳腺癌組58.2%(46/79)明顯高于對照組〔10%(2/20)〕，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=6.487,P<0.05)；乳腺癌組p16陽性表達位于細胞質(zhì)，呈棕黃色(圖3、4)，三陰乳腺癌陽性表達率為71.1%(28/39)、非三陰乳腺癌陽性表達率為42.5%(17/40)，乳腺癌組〔56.9%(45/79)〕明顯高于對照組〔5%(1/20)〕，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=8.815,P<0.01)；乳腺癌組Ki-67陽性表達位于細胞核，呈棕黃色(圖5、6)，三陰乳腺癌陽性表達率為76.9%(30/39)、非三陰乳腺癌陽性表達率為27.5%(11/40)，乳腺癌組〔51.8%(41/79)〕明顯高于對照組〔5%(1/20)〕，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=7.389,P<0.01)。

圖2 乳腺癌免疫組化p62陰性表達(×100)

圖3 乳腺癌免疫組化p16細胞質(zhì)強陽性表達(×100)

圖4 乳腺癌免疫組化p16陰性表達(×100)

圖5 乳腺癌免疫組化Ki-67細胞核陽性表達(×100)

圖6 乳腺癌免疫組化Ki-67陰性表達(×100)

2.2p62、p16和Ki-67表達與臨床病理特征的關(guān)系 p62陽性表達與組織學(xué)分級和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；p16和Ki-67陽性表達與組織學(xué)分級相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.3p62、p16和Ki-67表達與ER的關(guān)系 乳腺癌組p62、p16、Ki-67陽性表達與ER呈顯著負相關(guān)(P<0.05)。見表2。

2.4p62、p16和Ki-67相關(guān)性分析 乳腺癌組p62和Ki-67表達呈顯著正相關(guān)(P<0.01)；p16和Ki-67表達呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；p62和p16表達無相關(guān)性(P>0.05)。見表3。

表1 p62、p16和Ki-67表達與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系(n)

表2 p62、p16和Ki-67表達與ER的關(guān)系 (n)

表3 乳腺癌中p62、p16和Ki-67的相關(guān)性(n)

3 討 論

自噬是一種進化保守、亞細胞水平的自我吞噬，自噬基因的異常表達與一些腫瘤的形成密切相關(guān)。自噬相關(guān)蛋白p62是一種支架蛋白。自噬發(fā)生時，p62首先與細胞質(zhì)中泛素化蛋白結(jié)合，再與定位于自噬體內(nèi)膜上微管相關(guān)蛋白輕鏈3(LC3B)形成復(fù)合物，被自噬溶酶體降解。自噬過程中，p62蛋白在細胞質(zhì)中不斷被降解，自噬被抑制時，p62蛋白在細胞質(zhì)中不斷積累，因此p62可作為反映自噬活性的標記蛋白〔5〕。本實驗結(jié)果顯示，p62蛋白在乳腺癌細胞質(zhì)中表達明顯高于癌旁正常乳腺組織及乳腺良性腫瘤，p62在乳腺癌異常聚集表明自噬活性顯著減弱，自身受損、變性或衰老細胞器和大分子物質(zhì)得不到及時降解，導(dǎo)致活性氧大量產(chǎn)生，使乳腺正常組織DNA損傷，促使正常乳腺組織向癌進一步轉(zhuǎn)化。

p62蛋白在乳腺癌表達與臨床病理學(xué)參數(shù)關(guān)系的文獻鮮有報道。本實驗顯示，p62蛋白表達與組織學(xué)分級及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，表明p62陽性表達與腫瘤的惡性行為相關(guān)，其高表達預(yù)示乳腺癌惡性程度高，易發(fā)生轉(zhuǎn)移，是預(yù)后差的指標。Burdelski等〔6〕使用免疫組化技術(shù)檢測了前列腺癌組織中p62的表達，發(fā)現(xiàn)其表達與組織學(xué)分級及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，其研究結(jié)果與本實驗結(jié)果相似。

p16抑癌基因控制細胞分裂的原理是在G1卡點中，與細胞周期中Cyclin D1發(fā)生競爭，結(jié)合并且抑制CDK4活性，從而阻止細胞特別是損傷DNA的細胞進入S期〔7，8〕，其異常表達表現(xiàn)為過表達或表達下調(diào)。有研究〔9〕提出p16的過表達在惡性程度高的腫瘤中作用更突出，乳腺癌中可較多出現(xiàn)過表達。亦有文獻報道〔10〕在乳腺癌中會出現(xiàn)p16下調(diào)。

本實驗結(jié)果顯示，p16蛋白在乳腺癌細胞質(zhì)中彌漫強陽性表達，明顯高于癌旁正常乳腺組及乳腺良性腫瘤。提示p16高表達可能與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展具有一定的相關(guān)性，并且在三陰乳腺癌中高表達，預(yù)示p16有可能成為三陰乳腺癌的檢測指標。

本實驗顯示，p16蛋白表達與組織學(xué)分級相關(guān)，表明p16陽性表達與腫瘤的惡性行為相關(guān)，其高表達預(yù)示乳腺癌惡性程度高，易發(fā)生轉(zhuǎn)移，是預(yù)后差的指標。

Ki-67是一種與細胞增殖密切相關(guān)核抗原，是評價惡性腫瘤細胞增殖程度最可靠的指標。本研究結(jié)果表明，在乳腺癌組織中Ki-67陽性表達定位于細胞核，與癌旁正常乳腺組織及乳腺良性腫瘤表達差異顯著，Ki-67與組織學(xué)分級顯著相關(guān)，因此，在乳腺癌組織中Ki-67的高表達可提示腫瘤細胞增殖活躍，侵襲力強，易發(fā)生轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差。

p62、Ki-67呈顯著正相關(guān)表明兩者共同促進腫瘤發(fā)生，在乳腺癌中兩者高表達預(yù)示了腫瘤惡性程度高，侵襲力強，易發(fā)生轉(zhuǎn)移；

ER的缺失與p16的異常表達相關(guān)，p16的異常表達在低分化的癌組織陽性率高，與ER表達呈負相關(guān)，與Ki-67的表達正相關(guān)〔11〕，與本研究結(jié)果一致，提示p16有可能成為乳腺癌惡性程度及判斷預(yù)后有力檢測指標之一。

綜上所述，乳腺癌組織中存在著p62和Ki-67過度表達及p16蛋白異常表達，p62、p16和Ki-67可成為判斷乳腺癌組織分化程度及預(yù)后的實驗室指標。