過表達MiR-381調控LRH-1-MMP-2通路抑制卵巢癌細胞轉移的機制

李丹 李濤

(1崇州市人民醫院腫瘤科，四川 崇州 611230；2四川省腫瘤醫院)

近年來，卵巢癌在我國女性生殖系統腫瘤中的占比逐年升高〔1〕。卵巢癌早期無典型臨床表現，大多數患者就診時已處于疾病晚期，喪失了行根治性手術的機會〔2〕。對卵巢癌轉移分子機制的研究有助于提高卵巢癌患者手術切除率并改善患者長期預后。MicroRNA(miR)是單長度較短的RNA，通常其堿基數量在18～25 bp之間〔3〕。卵巢癌細胞增殖〔4〕、轉移〔5〕及血管生成〔6〕等惡性生物學過程中均證實有miR的參與。近年來研究表明，miR-381作為一種新的miR在胃癌〔7〕、結腸癌〔8〕及乳腺癌〔9〕中均表達降低，并能抑制腫瘤進展。目前，miR-381在卵巢癌中的表達水平及生物學功能尚不可知。本研究擬檢測miR-381在卵巢細胞癌中的表達情況。

1 材料和方法

1.1組織標本 選取2014年1月至2015年10月于崇州市人民醫院腫瘤科收治并行手術切除的45對卵巢癌及對應癌旁組織(距腫瘤邊緣距離>2 cm)標本。

1.2細胞來源及主要試劑 SKVO3細胞由四川省腫瘤醫院實驗室保存；慢病毒(miR-381及陰性對照)、miR-381及U6引物分別由廣州復能基因及廣州銳博生物科技有限公司提供；DMEM培養基、胎牛血清(FBS)、Trizol試劑、逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)試劑盒、實時熒光定量試劑盒、 肝受體同源物(LRH)-1抗體(ab125034)、基質金屬蛋白酶(MMP)-2抗體(ab97779)、β-actin抗體(ab8226)、Transwell小室及硝酸纖維素膜分別購自美國Gibco、美國Invitrogen公司、美國abcam公司、美國康寧公司和美國Millipore公司。

1.3反轉錄實時熒光定量(qRT)-PCR RNA由Trizol試劑按說明書提取。按說明分別組建RT-PCR及實時PCR體系。RT-PCR條件：50℃反轉錄30 min，94℃變性2 min，共1循環。實時PCR條件：94℃變性15 s，60℃退火30 s，68℃延伸3 min，共40循環；72℃最后延伸10 min。通過2-△△Ct法檢測miR-381的相對含量。

1.4細胞培養及慢病毒感染 培養SKVO3細胞至穩定傳代。按過夜增殖至融合度達70%，將SKVO3細胞接種于6孔板中。過夜培養后洗滌細胞。慢病毒感染分組：miR-381組每孔加入1 ml的miR-381慢病毒上清液、2 ml含血清DMEM及15 μg嘌呤霉素；miR-NC組即對照組每孔加入1 ml的陰性對照慢病毒上清液、2 ml含血清DMEM及15 μg嘌呤霉素。轉染2 d后，使用特性抗生素溶液篩選穩定轉染SKVO3細胞。

1.5劃痕愈合試驗 在6孔板中均勻接種穩定轉染的SKVO3細胞。100 μl的槍頭建立細胞劃痕，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗6孔板，每孔加入2 ml無血清DMEM。培養48 h后在顯微鏡下觀察細胞遷移情況并拍照。

1.6Transwell侵襲小室 用1×DMEM按8∶1稀釋50 mg/L的基質膠，按100 μl每孔包被Transwell小室底膜上室面，4℃風干后放入24孔板內。收集轉染穩定過表達miR-381的SKVO3細胞，以無血清DMEM培養基重懸后調整細胞密度為1×105/ml，按250 μl每孔接種于Transwell小室上室中，24孔板內每孔加入750 μl含10%FBS的DMEM培養基。培養箱內培養24 h后棄去上室內培養基，PBS洗滌2遍后采用4%多聚甲醛固定，結晶紫染色，棉棒擦去上室面殘余細胞，在200倍顯微鏡下觀察下室面細胞并計數。

1.7裸鼠肺轉移瘤模型構建 隨機選取BALB/c裸鼠6只，約5周齡大小，平均分為2組：miR-381組及miR-NC組。將穩定轉染miR-381及miR-NC的SKVO3細胞制備成為2.0×105/ml密度的PBS細胞懸液。每只裸鼠經尾靜脈注射0.1 ml細胞懸液，建立腫瘤血循環轉移模型。裸鼠飼養4 w后處死，獲取肺組織。甲醛溶液固定后制作蘇木素-伊紅(HE)染色切片。

1.8Western印跡法檢測LRH-1蛋白、基質金屬蛋白酶(MMP)2 檢測細胞總蛋白采用放射免疫沉淀法(RIPA)提取，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，70 V濕轉120 min轉印目標蛋白至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，封閉液室溫封閉2 h后將目標條帶分別置入相應一抗溶液中，4℃下孵育過夜。1∶5 000稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標記二抗在室溫中孵育目標條帶1 h。電化學發光法顯影，自動曝光機固定條帶影像，計算蛋白相對表達量。

1.9統計學分析 采用SPSS13.0軟件進行χ2檢驗、成組t檢驗。

2 結 果

2.1miR-381在卵巢癌組織中低表達 通過RTPCR檢測發現，45例卵巢癌組織中miR-381的表達水平(0.411±0.027)顯著低于癌旁組織(1.208±0.031，t=5.221，P=0.017)。

2.2miR-381抑制SKVO3細胞增殖并促進其凋亡 感染miR-381慢病毒的細胞內miR-381表達水平(22.35±5.12)較miR-NC組(1.00±0.00)顯著升高(t=17.341，P<0.001)。劃痕愈合試驗檢測得知，過表達miR-381組剩余距離百分比為(76.28±10.89)%，miR-NC組為(48.39±8.23)%，過表達miR-38在體外顯著降低了SKVO3細胞的遷移能力(t=4.113，P=0.025)；Transwell侵襲小室試驗也表明，過表達miR-381組侵襲細胞數目〔(23.47±7.29)%〕顯著低于miR-NC組侵襲細胞數目〔(78.28±8.41)%，t=3.682，P=0.031〕。見圖1、圖2。

2.3過表達miR-381抑制裸鼠肺轉移瘤形成 過表達miR-381后SKVO3細胞在裸鼠肺臟中形成的腫瘤結節的面積〔(16.43±5.44)mm2〕顯著低于miR-NC組〔(41.03±17.39)mm2，t=3.327，P=0.039〕。見圖3。

圖1 過表達miR-381抑制卵巢癌SKV03細胞遷移(×200)

圖2 過表達miR-381抑制SKVO3細胞侵襲(結晶紫染色，×200)

圖3 過表達miR-381表達對SKVO3細胞裸鼠肺轉移結節形成的影響(HE，×100)

2.4過表達miR-381抑制SKVO3細胞中LRH-1及下游靶點MMP-2的表達 與miR-NC組相比，過表達miR-381的SKVO3細胞內LRH-1 mRNA及蛋白水平均顯著降低(P<0.05、P<0.01)，LRH-1下游效應基因MMP-2蛋白的表達也明顯下調(P<0.05)。提示miR-381可能是通過下調LRH-1/MMP-2的表達來發揮抗腫瘤效應。見圖4、表1。

圖4 過表達miR-381下調LRH-1、MMP-2蛋白表達

表1 過表達miR-381對SKVO3細胞內LRH-1及MMP-2表達的影響

3 討 論

miR-381在不同類型的惡性腫瘤中的表達趨勢并不一致。本研究說明miR-381在卵巢癌中可能是一種抑癌因子。通過實驗證實，miR-381在體外培養細胞和機體內環境中均具有一定的抑制腫瘤細胞侵襲轉移的作用。除此之外，有研究指出，miR-381也能夠抑制癌細胞活性和增殖能力，最終削弱癌細胞的生長〔10〕。

靶向結合目的基因mRNA的3'-非翻譯區是miR發揮負向表達調控作用的經典機制。通過檢索分析發現，LRH-1的mRNA存在miR-381的結合位點〔11〕。既往研究也表明LRH-1高表達是卵巢癌進展的促進因素〔12,13〕。本文顯示過表達miR-381在體外的確能下調LRH-1的表達水平。在多種疾病模型中的研究結果表明LRH-1能夠調節包括Wnt/β-catenin在內的多條信號通路而影響細胞的生物學特性〔14〕。研究表明，與腫瘤細胞侵襲轉移相關的MMP-2也是LRH-1的下游效應分子之一〔15〕。在本研究提示miR-381抑制腫瘤轉移的作用最終可能是通過下調MMP-2表達而實現的。

綜上，miR-381在卵巢癌中低表達，上調miR-381可能通過抑制LRH-1、MMP-2的表達而抑制卵巢細胞癌轉移。