高通量測序技術研究不同喂養和分娩方式對不同月齡嬰幼兒腸道菌群的影響

楊 莉，葛武鵬,*，梁秀珍，張 靜，王西寧，張 雪，崔秀秀，龔 勝

（1.西北農林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100；2.陜西飛天乳業有限公司，陜西 寶雞 721100；3.楊凌示范區醫院，陜西 楊凌 712100；4.西安百躍羊乳集團有限公司，陜西 西安 710000）

微生物與人體高度共生，在人體腸道中數量、種類多，甚至被看作一個人體“器官”，其構成極為復雜多樣，已有大量研究表明腸道微生物與人體的諸多疾病，如炎癥、肥胖癥、糖尿病、腫瘤等顯著相關[1-2]。人生初期的1 000 d是腸道菌群定植關鍵期，遺傳、環境、月齡、分娩方式及喂養方式均影響腸道微生物的定植[3-4]。在諸多因素中，喂養方式、分娩方式及月齡對腸道菌群影響較為顯著。有研究表明，喂養方式對6 月齡的嬰幼兒腸道菌群構建和生長發育影響顯著[5-8]。母乳作為嬰幼兒的首選食物，除了能提供嬰幼兒所需的各種營養物質之外，還含有豐富的微生物信息及免疫因子，可使微生物快速定植在嬰幼兒腸道中，這些腸道菌群的定植有助于嬰幼兒先天免疫系統的形成[9]。母乳喂養的嬰幼兒患病率（如過敏性疾病、自身免疫性疾病和肥胖癥等）大幅降低[9-11]。由于受到社會因素、生理原因、個人健康等因素的影響，我國母乳喂養率偏低，所以選擇適宜的配方奶粉對嬰幼兒成長發育至關重要。近年來，人們對山羊乳的營養價值、生物利用率及功能等方面進行了大量系統性研究，取得較大進展，以山羊乳為基質的嬰配奶粉也越來越受到青睞，特別是對過敏或患腸道疾病的嬰幼兒尤為有益[12-13]。但目前對于羊乳配方粉、牛乳配方粉及母乳喂養對嬰幼兒腸道菌群構建的影響鮮見報道。

分娩方式亦是嬰幼兒腸道菌群構建的關鍵因素之一，影響著早期嬰幼兒腸道微生態的形成[14-15]，新生兒腸道菌群的構建及多樣性主要取決于母體和新生兒之間的菌群交換，剖宮產破壞了母嬰之間腸道菌群的交換方式，使新生兒突然從子宮環境來到外界環境，從而造成新生兒的腸道菌群傳遞鏈條缺失，增加了嬰幼兒患腹腔疾病及肥胖的風險[1,16-17]。而目前尚鮮有在相同月齡、相同喂養方式下研究分娩方式對嬰幼兒腸道菌群的影響，也鮮有在相同月齡、相同分娩方式下喂養母乳、牛乳、羊乳配方粉對嬰幼兒腸道菌群影響的差異分析，不同的分娩方式及喂養方式對嬰幼兒腸道菌群的構建具有重要的影響。因此，本研究基于高通量測序（Illumina）技術探討不同喂養方式、不同分娩方式（順產、剖宮產）對不同月齡（I段：0～6 個月、II段：6～12 個月、III段：12～36 個月）嬰幼兒腸道菌群構建的影響，重點分析了在其他兩種因素相同的情況下，喂養方式、分娩方式、月齡對嬰幼兒腸道菌群的影響，降低其他差異造成的影響，從而為嬰配食品開發及嬰幼兒科學喂養提供較為準確的技術支撐，為嬰幼兒的健康成長提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糞便基因組DNA提取試劑盒 北京天根生化科技有限公司；GeneJET膠回收試劑盒、Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns建庫試劑盒 美國Thermo Scientific公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-2D型雙人單面超凈臺 蘇州凈化設備有限公司；TDL-5-A型低速臺式離心機 上海安亭科學儀器廠；立式蒸汽滅菌器 上海博迅實業有限公司醫療設備廠；T100型聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國Bio-Rad公司；Ion S5TMXL美國Thermo Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 嬰幼兒糞便樣本的采集

糞便樣本采集于陜西地區0～36 個月內健康嬰幼兒，均為足月正常體質量新生兒，一周內無腹瀉、無胃腸道病史、未使用過任何抗生素類藥物。根據采樣原則及分組共采集嬰兒糞便樣本54 份，包括0～6 月（I段）順產母乳喂養（MV1）嬰幼兒6 名，0～6 月剖宮產母乳喂養（MF1）嬰幼兒6 名，0～6 月順產羊乳配方粉喂養（YV1）嬰幼兒6 名，6～12 月（II段）順產羊乳配方粉喂養（YV2）嬰幼兒6 名，12～36 月（III段）順產羊乳配方粉喂養（YV3）嬰幼兒6 名，6～12 月剖宮產羊乳配方粉喂養（YF2）嬰幼兒6 名，12～36 月剖宮產羊乳配方粉喂養（YF3）嬰幼兒6 名，6～12 月順產牛乳配方粉喂養（NV2）嬰幼兒6 名，12～36 月順產牛乳配方粉喂養（NV3）嬰幼兒6 名。采集糞便時，采取糞便內部，避免混入尿液和其他雜質，放于無菌采樣器中，并于2 h內送入實驗室，凍存于－80 ℃冰箱。

1.3.2 DNA提取和測序

采用十六烷基三甲基溴化銨方法提取樣本的基因組DNA，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和質量濃度，取適量的樣品于離心管中，使用無菌水稀釋樣品至1 ng/μL。以稀釋后的基因組DNA為模板對16S rRNA基因V3～V4區對樣品進行PCR擴增。使用帶Barcode的特異引物（515F-806R）。根據PCR產物質量濃度進行等體積混樣，充分混勻后使用1×TAE緩沖液配制的質量分數2%瓊脂糖膠電泳純化，剪切回收目標條帶。使用GeneJET膠回收試劑盒回收產物。使用Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns建庫試劑盒進行文庫的構建，構建好的文庫經過Qubit法定量且文庫檢測合格后，使用Ion S5TMXL進行測序。

1.3.3 生物信息學分析

利用Uparse軟件[18]對所有樣品的全部Clean Reads進行聚類，以97%的一致性將序列聚類成為操作分類單元（operational taxonomic units，OTUs），對OTUs代表序列進行物種注釋，綜合運用Mothur方法、SILVA數據庫[19]和真核微生物的小亞基rRNA數據庫[20]對物種進行注釋分析，獲得分類學信息，并分別在各個分類水平統計各樣本的群落組成。使用MUSCLE軟件[21]進行快速多序列比對，得到所有OTUs代表序列的系統發生關系。最后對各樣品的數據進行均一化處理，以樣品中數據量最少的OTUs為標準進行均一化處理，后續的Alpha多樣性分析和Beta多樣性分析都是基于均一化處理后的數據。Alpha多樣性分析反映樣品的菌群豐度和多樣性，其描述方法有Chao1指數、ACE指數、Shannon指數、Simpson指數。Chao1、ACE指數越大，表明菌群豐度越高；Shannon指數越大，說明群落多樣性越高；Simpson指數越大，說明群落多樣性越低。Beta多樣性分析中的LefSe分析使用LefSe軟件，設置線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）得分的篩選值為4。

1.4 數據統計與分析

菌群多樣性數據以平均值±標準差表示，采用SPSS Statistics 20.0軟件進行單因素方差分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 各組嬰幼兒腸道菌群豐度及多樣性

圖1 各組嬰幼兒腸道菌群稀釋曲線Fig. 1 Rarefaction curve of intestinal flora in infants from each group

由圖1可知，隨著測序數據量的增加，曲線趨于平緩，說明測序深度已經基本覆蓋到樣品中所有的物種。當測序數據量相同時，除III段嬰幼兒以外，順產嬰幼兒菌群多樣性高于剖宮產，這是因為剖宮產破壞了母嬰之間腸道菌群的交換，順產嬰幼兒菌群多樣性較高；羊乳配方粉喂養組菌群多樣性高于母乳喂養和牛乳配方粉喂養組，這為選擇合適的配方粉提供了參考依據。在順產羊乳配方粉喂養的嬰幼兒中，II段嬰幼兒菌群多樣性最高，III段次之，I段最低，推測與嬰幼兒的健康發育相關，II段作為嬰幼兒系統發育成熟的關鍵時期，生長所需營養及熱能量最多，故嬰幼兒腸道菌群最為豐富，多樣性最高。

2.2 分娩方式對相同喂養方式、相同月齡嬰幼兒腸道菌群的影響

表1 不同分娩方式各組嬰幼兒腸道菌群的OTU數量及Alpha多樣性Table 1 OTU number and alpha diversity of intestinal flora in infants born by different delivery modes

表1結果表明，在所有樣品中，I段母乳喂養組和II段羊乳配方粉喂養組不同分娩方式下微生物豐度差異不顯著，在III段羊乳配方粉喂養組中，分娩方式不同，微生物豐度差異顯著，這是由于III段嬰幼兒輔食種類多，從而導致微生物豐度差異較大[22-23]。同時，Alpha多樣性分析也表明，在I段、II段喂養組中，順產和剖宮產組各指標差異不顯著，但在I段喂養組中Chao1指數差異顯著。在III段喂養組中，兩種分娩方式下嬰幼兒糞便腸道菌群的多樣性構成存在明顯差異。

圖2 各組嬰幼兒腸道菌群在門水平上的相對豐度Fig. 2 Relative abundance of intestinal flora in infants from each group at the level of phylum

通過對所有樣品中微生物的16S rRNA基因V3～V4區序列進行測序，由圖2可知，共檢測到10 個主要菌門，但是所有樣品中99.09%以上的序列主要由4 個菌門組成，分別是Actinobacteria（放線菌門）、Firmicutes（厚壁菌門）、Bacteroidets（擬桿菌門）、Proteobacteria（變形菌門）。所有樣品均以Actinobacteria、Firmicutes為優勢菌門。MV1組中Actinobacteria、Firmicutes、Bacteroidets和Proteobacteria的相對豐度分別是43.74%、25.48%、17.93%、9.71%；MF1組分別為40.83%、44.31%、3.81%、11.01%；YV2組分別為41.44%、43.84%、8.38%、6.27%；YF2組分別為60.76%、24.85%、8.66%、5.70%；YV3組分別為26.58%、47.73%、24.07%、1.58%；YF3組分別為34.77%、51.94%、11.10%、2.16%；YV1組分別是62.98%、15.23%、15.45%、1.51%；YV2組分別是41.44%、43.84%、8.38%、6.27%；NV2組分別是54.20%、35.71%、3.91%、6.11%；YV3組分別是26.58%、47.73%、24.07%、1.58%；NV3組分別是13.87%、63.53%、21.29%、1.29%。在0～6 月母乳喂養組中，順產嬰幼兒和剖宮產嬰幼兒優勢菌群組成相同，但順產嬰幼兒Actinobacteria豐度較高，剖宮產嬰幼兒Firmicutes豐度明顯高于順產嬰幼兒；在6～12 月羊乳配方粉喂養組中，順產嬰幼兒Firmicutes豐度高于剖宮產嬰幼兒，但剖宮產嬰幼兒Actinobacteria豐度高于順產嬰幼兒；在12～36 月羊乳配方粉喂養組中，順產嬰幼兒Actinobacteria、Firmicutes豐度均低于剖宮產嬰幼兒。在0～6 月母乳喂養組中，順產組檢測到了Verrucomicrobia（疣微球菌門），而剖宮產組沒有檢測到。盡管統計學分析表明4 種菌門在相同月齡、相同喂養方式下差異不顯著（P＞0.05），但分娩方式不同，優勢菌門構成比例存在一定差異。在0～6 月母乳喂養組中，順產組比剖宮產組Actinobacteria相對豐度更高，Firmicutes較少，可能與剖宮產影響了新生兒的腸道菌群相關，本研究結果也為進一步了解分娩方式與嬰幼兒健康發育之間的關聯提供依據。

由圖3可以看出，在科水平上，在0～6 月母乳喂養組中，順產組以Staphylococcaceae（鏈球菌科）為優勢菌，而剖宮產組以Clostridiaceae（梭菌科）為優勢菌；在6～12 月羊乳配方粉喂養組中，順產組中優勢菌為Enterobacteriaceae（腸桿菌科），剖宮產組中優勢菌為Prevotellaceae（普氏菌科）；在12～36 月羊乳配方粉喂養組中，順產組以Bacteroidaceae（擬桿菌科）和Ruminococcaceae（瘤胃菌科）為優勢菌，剖宮產組以Alcaligenaceae(糞產堿菌)為優勢菌。

綜上，在相同喂養方式、相同月齡嬰幼兒中，分娩方式對嬰幼兒腸道菌群構建多樣性影響不顯著，但是顯著影響主要優勢菌的豐度。

圖3 各組嬰幼兒腸道菌群豐度聚類圖Fig. 3 Species abundance of intestinal flora in infants from each group

2.3 喂養方式對相同月齡、相同分娩方式嬰幼兒腸道菌群的影響

表2 不同喂養方式各組嬰幼兒腸道菌群的OTU數量及Alpha多樣性Table 2 OTU number and alpha diversity of intestinal flora in infants fed by different methods

由表2可知，在I段順產組，羊乳配方粉喂養組OTU數量高于母乳喂養組，表明羊乳配方粉喂養組腸道菌群豐度較高；其ACE指數和Chao1指數顯著高于母乳喂養組，也表明了羊乳配方粉喂養組腸道菌群豐度較高；而兩組Shannon指數和Simpson指數無顯著差異。在II段順產組中，羊乳配方粉喂養組腸道菌群豐度略高于牛乳配方粉喂養組，但差異不顯著。王逸斌等[12]的研究表明，喂養羊乳配方粉對嬰幼兒的生長發育有促進作用，而本研究從基因層次闡明了羊乳配方粉對嬰幼兒健康成長有一定的促進作用。在III段順產組中，兩種喂養方式差異顯著，這是由于12～36 月齡的嬰幼兒加入大量輔食，配方粉添加量相對較少[23]。

圖4 各組嬰幼兒腸道菌群結構差異性分析Fig. 4 Analysis of difference in intestinal community structure between groups

圖4 A顯示I段順產嬰幼兒中母乳喂養組和羊乳配方粉喂養組間有差異（R＞0），但差異不顯著（P＞0.05）；圖4B表明II段順產嬰幼兒中羊乳配方粉喂養組和牛乳配方粉喂養組無差異（R＜0）；圖4C表明III段順產嬰幼兒中羊乳配方粉和牛乳配方粉喂養組間差異極顯著（P＜0.01），與表4得到的結論一致。

圖5顯示，在屬水平上，I段順產嬰幼兒中，母乳喂養和羊乳配方粉喂養主要由Bifidobacterium（雙歧桿菌屬）、Clostridium_sensu_stricto_1（梭菌屬）、Bacteroides（擬桿菌屬）組成，羊乳配方粉喂養嬰幼兒的Bifidobacterium豐度大于母乳喂養，而母乳喂養嬰幼兒的Clostridium_sensu_stricto_1、Bacteroides豐度略大于羊乳喂養；II段順產嬰幼兒中，牛乳配方粉和羊乳配方粉喂養嬰幼兒在屬水平菌群組成無顯著差異，但羊乳配方粉喂養組Bacteroides、Enterococcus（腸球菌屬）豐度略大于牛乳配方粉喂養組，而Bifidobacterium、Streptococcus（鏈球菌屬）略小于牛乳配方粉喂養組；III段順產嬰幼兒中，兩組Bifidobacterium的豐度都明顯小于I、II段嬰幼兒，而羊乳配方粉喂養組Bifidobacterium、Bacteroides、Prevotella_9（普拉梭菌屬）的豐度都高于牛乳配方粉喂養組。這與之前的研究結果[7]有差異，可能的原因是本研究在相同的分娩方式、相同的月齡下進行，降低了其他差異造成的影響。因此，不同月齡下的嬰幼兒腸道菌群豐度有顯著差異，對于相同月齡、相同分娩方式的嬰幼兒，母乳、羊乳配方粉、牛乳配方粉喂養組腸道菌群組成無明顯差異，但豐度存在著一定的差異。

圖5 各組嬰幼兒腸道菌群在屬水平上的相對豐度Fig. 5 Relative abundance of intestinal flora in infants from each group at the level of genus

2.4 月齡對羊乳配方粉喂養順產嬰幼兒腸道菌群的影響

由圖2可以看出，在門水平上，0～6、6～12、12～36 月羊乳配方粉順產嬰幼兒中的優勢菌組成無顯著差異，但其構成豐度存在一定差異，4 種優勢菌門分別占I、II、III段所有菌門的95.17%、99.94%、99.96%。Actinobacteria豐度在I段嬰幼兒中最高，II段次之，III段最低；Firmicutes、Bacteroidets和Proteobacteria豐度在II段嬰幼兒中最高，I段次之，III段最低。說明隨著嬰幼兒的生長發育，腸道菌群有著明顯變化。因此，本實驗在相同的分娩方式和喂養方式下研究3 個月齡嬰幼兒腸道菌群的定植。

對3 個月齡階段順產羊乳配方粉喂養嬰幼兒進行LefSe分析，不同月齡嬰幼兒腸道菌群組成存在一定差異。如圖6A所示，6～12 月順產羊乳配方粉喂養組區別于其他兩組的微生物菌群分別是Enterococcaceae（腸球菌科）、Lactobacillales（乳桿菌目）、Bacilli（芽孢桿菌綱）、Clostridiaceae（梭菌科）、Veillonellaceae（韋榮氏球菌科）、Selenomonadales、Negativicutes、Enterobacteriaceae（腸桿菌科）、Enterobacteriales（腸桿菌目）；12～36 月順產羊乳配方粉喂養組中Ruminococcaceae（瘤胃球菌科）是優勢菌群。由圖6B可知，假鏈狀雙歧桿菌是0～6 月嬰幼兒中的優勢菌種；Ruminococcaceae和青春雙歧桿菌是12～36 月嬰幼兒優勢菌；Lactobacillales、Enterococcaceae、Clostridiaceae、Veillonellaceae是6～12 月嬰幼兒的優勢菌。6～12 月嬰幼兒中腸道菌群最豐富。

圖6 不同月齡羊乳配方粉喂養順產嬰幼兒腸道菌群的差異Fig. 6 Difference in intestinal flora in infants of different ages

3 討 論

嬰幼兒腸道微生物的建立是一個復雜的過程，其定植的過程受多種因素的影響，其中喂養方式、月齡和分娩方式是嬰幼兒腸道菌群建立的主要因素。之前雖然有關于喂養方式和分娩方式對嬰幼兒腸道菌群影響的研究，但在相同月齡、相同喂養方式下分娩方式對嬰幼兒腸道菌群影響的研究甚少，而且鮮有研究在相同月齡、相同分娩方式下進行喂養母乳、牛乳、羊乳配方粉對嬰幼兒腸道菌群影響的差異分析。因此，本研究重點分析了在其他兩種因素相同的情況下，喂養方式、分娩方式、月齡對嬰幼兒腸道菌群的影響。

3.1 分娩方式對相同月齡、相同喂養方式嬰幼兒腸道菌群的影響

有研究表明，早期微生物在嬰幼兒腸道中的定植受分娩方式的影響，定植在順產和剖宮產嬰幼兒腸道中的微生物不同[22-24]。本研究通過高通量測序技術分析分娩方式對相同喂養方式、不同月齡下的嬰幼兒腸道菌群的影響，與文獻[22-24]的結果不同。結果表明，在I、II段喂養組中，分娩方式不同，嬰幼兒微生物豐度有差異但不顯著，而在III段喂養組中微生物豐度差異顯著，是由于III段喂養組輔食的添加占主導，嬰幼兒個體差異較大，最近也有研究表明分娩方式未對嬰幼兒生長發育產生影響[25]，也佐證了本研究結果。

3.2 喂養方式對相同月齡、相同分娩方式嬰幼兒腸道菌群的影響

一些研究報道，在新生兒期，母乳喂養和人工喂養嬰幼兒腸道菌群均以雙歧桿菌為優勢菌，但在母乳喂養嬰幼兒腸道中雙歧桿菌豐度較高[26]；而人工喂養嬰幼兒糞便中擬桿菌、腸桿菌、梭菌、腸球菌、鏈球菌等的豐度要高于母乳喂養嬰幼兒[13]。另外一些研究認為，母乳喂養嬰幼兒與人工喂養嬰幼兒糞便中均含有大量的腸桿菌，而雙歧桿菌數量在兩組之間沒有太大區別[27]。早期對嬰幼兒腸道菌群的研究主要建立在傳統培養技術上，研究結果存在較大爭議。近十幾年來，Haarman等采用熒光原位雜交及核酸探針技術對出生后20 d內母乳喂養和人工喂養嬰幼兒腸道菌群進行了對比，發現所有母乳喂養嬰幼兒腸道均以雙歧桿菌為優勢菌，其次是乳酸桿菌和鏈球菌；而人工喂養嬰幼兒腸道中乳酸桿菌和雙歧桿菌的數量相似[28]。本實驗基于高通量測序技術，研究在月齡、分娩方式相同的情況下喂養方式對嬰幼兒腸道菌群的影響，結果發現在0～6 月順產嬰幼兒中，Actinobacteria在羊乳配方粉喂養組占62.98%，遠高于母乳喂養組（43.74%）；羊乳配方粉喂養組雙歧桿菌豐度也高于母乳喂養組。這一結果作為喂養方式對嬰幼兒腸道菌群的新發現，對嬰幼兒配方粉的開發有一定價值。

雖然母乳喂養被認為是金標準，母乳是嬰幼兒生長發育最理想的營養物質，但由于各種原因導致我國母乳喂養率偏低，而羊乳以其低致敏性和高營養價值的優勢，更適合作為嬰幼兒配方奶粉的原料[13,25,29]。本研究采用高通量測序技術檢測，發現I段順產嬰幼兒中母乳喂養和羊乳配方粉喂養組間腸道菌群有差異但不顯著，母乳喂養和羊乳配方粉喂養主要由Bifidobacterium、Clostridium_sensu_stricto_1、Bacteroides組成，并且羊乳配方粉喂養的嬰幼兒Bifidobacterium豐度大于母乳喂養；II段順產嬰幼兒中羊乳配方粉喂養組和牛乳配方粉喂養組無顯著差異；III段順產嬰幼兒中羊乳配方粉和牛乳配方粉喂養組間差異明顯，兩組不同喂養方式Bifidobacterium的豐度都明顯小于I、II段嬰幼兒，而羊乳配方粉喂養組Bifidobacterium、Bacteroides、Prevotella_9的豐度都高于牛乳配方粉喂養組。

3.3 月齡對相同分娩方式、相同喂養方式嬰幼兒腸道菌群的影響

嬰幼兒腸道菌群的建立是一個動態演變的過程，而嬰幼兒期腸道微生物組成與機體病變有很大關系，因此研究嬰幼兒期腸道微生態以及合理建立尤為重要，但很少有對嬰幼兒0～36 個月整個階段腸道菌群變化的研究。本研究通過排除喂養方式和分娩方式的影響，選擇順產喂養羊乳配方粉的嬰幼兒，降低了其他因素的影響，利用高通量測序技術比較了嬰幼兒3 個階段腸道菌群的變化。發現3 個階段優勢菌門都是由Actinobacteria、Firmicutes、Bacteroidets和Proteobacteria組成，但是豐度存在明顯差異，隨著月齡的增長，Actinobacteria和Bifidobacterium的豐度逐漸降低；6～12 月嬰幼兒Lactobacillales相對豐度較I、III段更高。本研究結果為配方粉的研發提供理論依據。

目前，關于分娩方式及月齡相同的條件下，羊乳配方粉對腸道菌群影響的研究甚少，故本實驗通過高通量測序技術研究了分娩方式、喂養方式、月齡對嬰幼兒腸道菌群的影響，表明相同喂養方式、相同月齡的嬰幼兒，分娩方式對其腸道菌群的影響有一定差異；相同分娩方式、相同月齡時，喂養羊乳配方粉的嬰幼兒腸道菌群豐度更高。本研究對相同分娩方式、相同喂養方式的嬰幼兒在生命初期（0～36 個月）腸道菌群組成、結構進行分析，為嬰幼兒的健康、代謝及相關疾病的防御提供參考依據。