老年膿毒癥患者轉化生長因子-β1/Smad信號通路、炎癥因子及外周血microRNA-155和-466的表達及意義

潘田君 袁盛偉

(1臺州市中心醫院 臺州學院附屬醫院重癥醫學科，浙江 臺州 318000；2浙江省舟山醫院重癥醫學科)

膿毒癥是創傷、燒傷、感染等急危患者的一種嚴重并發癥，其病情較為兇險，可發展為多器官衰竭、嚴重膿毒癥、膿毒癥休克等，其發病率和病死率較高，嚴重威脅患者生命安全〔1,2〕。因此，采取早期、正確診斷能夠改善膿毒癥預后〔3〕。全身炎性反應綜合征是膿毒癥的病理生理變化主要表現〔4〕。轉化生長因子(TGF)-β信號從細胞膜傳入細胞核，與基因表達耦聯，主要依賴Smads家族蛋白調節，其中Smad蛋白是TGF-β信號通路中關鍵步驟。隨著近年來關于TGF-β/Smad信號通路的不斷研究，其在膿毒癥中的作用越來越受到關注〔5〕。微小RNA(microRNA)與多種疾病發生、生理及病理過程密切相關。相關研究表明，膿毒癥外周血中microRNA可于一定程度上反映機體炎癥情況，從而判定疾病嚴重程度〔6〕。本研究探討老年膿毒癥患者TGF-β/Smad信號通路、炎癥因子及外周血microRNA-155和microRNA-466的表達及意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇臺州學院附屬醫院于2014年6月至2017年12月收治的老年膿毒癥患者87例，男52例，女35例；年齡65～75〔平均(70.89±5.71)〕歲；其中膿毒癥組27例，男16例，女11例，平均年齡(71.02±5.46)歲，嚴重膿毒癥組34例，男20例，女14例，平均年齡(70.57±4.71)歲，膿毒癥休克組26例，男16例，女10例，平均年齡(70.83±6.41)歲。另選擇同期健康體檢者50例作為對照組，男31例，女19例；年齡65～74〔平均(70.75±4.27)〕歲。各組性別(χ2=0.891)，平均年齡(F=0.473)，差異無統計學意義(均P>0.05)。所有研究對象均知情同意。

1.2方法

1.2.1TGF-β/Smad信號通路檢測 所有研究對象于入院12 h內采取外周靜脈血3 ml，以離心半徑15 cm，2 500 r/min，離心10 min，分離血清，采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測血清TGF-β1、Smad2和Smad7水平。

1.2.2炎癥因子檢測 包括降鈣素原(PCT)、白細胞介素(IL)-23和C反應蛋白(CRP)，所有研究對象采取外周靜脈血3 ml，以離心半徑15 cm，2 500 r/min，離心10 min，分離血清，采用免疫發光夾心法檢測PCT含量，采用ELISA檢測IL-23含量，采用酶速率散射比濁法檢測CRP含量。

1.2.3外周血microRNA-155和microRNA-466表達檢測 所有研究對象采取外周靜脈血3 ml，采用TRIzol一步法提取總RNA，操作步驟嚴格按照美國Invitrogen公司TRIzol試劑盒檢測。總RNA的吸光度值采用紫外分光光度計測定。由上海生工生物工程股份有限公司合成引物。反應總體積25 μl。反應條件：95℃ 15 min預變性，95℃ 15 s，60℃ 60 s，共35個循環。microRNA-155和microRNA-466相對表達量采用2-ΔΔCt法計算。

1.3觀察指標 ①觀察各組急性生理學與慢性健康狀況評分系統(APACHE)Ⅱ評分和序貫器官功能障礙評分(SOFA)變化；②觀察各組TGF-β/Smad信號通路變化；③觀察各組炎癥因子變化；④觀察各組外周血microRNA-155和microRNA-466表達。

1.4統計學方法 應用SPSS19.0統計軟件進行t、F及χ2檢驗。

2 結 果

2.1各組APACHE Ⅱ評分和SOFA評分比較 見表1，膿毒癥休克組、嚴重膿毒癥組和膿毒癥組APACHE Ⅱ評分和SOFA評分均明顯高于對照組，膿毒癥休克組明顯高于嚴重膿毒癥組和膿毒癥組，且嚴重膿毒癥明顯高于膿毒癥組，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2各組TGF-β/Smad信號通路水平比較 見表2，膿毒癥休克組、嚴重膿毒癥組和膿毒癥組TGF-β1、Smad2和Smad7水平均明顯高于對照組，膿毒癥休克組明顯高于嚴重膿毒癥組和膿毒癥組，且嚴重膿毒癥明顯高于高于膿毒癥組，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.3各組炎癥因子水平比較 見表2，膿毒癥休克組、嚴重膿毒癥組和膿毒癥組PCT、IL-23和CRP水平明顯高于對照組，膿毒癥休克組明顯高于嚴重膿毒癥組和膿毒癥組，且嚴重膿毒癥明顯高于膿毒癥組，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.4各組外周血microRNA-155和microRNA-466表達比較 見表3，膿毒癥休克組、嚴重膿毒癥組和膿毒癥組外周血microRNA-155和microRNA-466表達明顯高于對照組，膿毒癥休克組明顯高于嚴重膿毒癥組和膿毒癥組，且嚴重膿毒癥明顯高于膿毒癥組，差異有統計學意義(P<0.05)。

表1 各組APACHE Ⅱ評分和SOFA評分比較分)

與對照組比較：1)P<0.05；與膿毒癥組比較：2)P<0.05；與嚴重膿毒癥組比較：3)P<0.05，下表同

表2 各組TGF-β/Smad信號通路、炎癥因子水平比較

表3 各組外周血microRNA-155和microRNA-466表達比較

3 討 論

隨著有創操作的不斷發展及多發傷的增多，膿毒癥的發病率呈上升趨勢，已嚴重威脅人類健康。膿毒癥病情變化迅速，并且預后較差〔7～10〕。因此，臨床上針對膿毒癥患者采取及時有效的診斷和治療尤為重要〔11～13〕。

TGF-β主要是一種由多細胞分泌的多功能生長因子。相關研究報道顯示，TGF-β參與膿毒癥的發生且在下調炎癥中具有重要作用〔14〕。TGF-β可下調膿毒癥炎癥級聯反應，對抗炎癥反應過度，降低前炎癥因子釋放，對機體具有一定保護作用。相關研究表明，體外TGF-β可阻斷前炎癥因子以及膿毒癥血清誘導的心肌細胞抑制〔15〕。同時TGF-β還可抑制一氧化氮合酶(NOS)2轉錄的活性，從而降低一氧化氮生成。一氧化氮過度產生是誘導膿毒癥休克發生的關鍵介質，可引起心肌細胞收縮力降低、血管收縮劑反應性下降及血管病理性擴張等病理改變。Smad蛋白家族介導TGF-β受體激活后獨特的細胞內信號轉導通路。

PCT為降鈣素的前肽，主要由116個氨基酸組成。血清中PCT半數半衰期為20～24 h。當出現膿毒癥時，PCT水平顯著上升。通常當機體受到內毒素刺激3～4 h后，PCT則被釋放進入循環，并且其水平在8～24 h后達到高峰，認為PCT可作為診斷危重癥患者感染的一種有效標志物，并且可用于監控膿毒癥的病情變化〔16〕。IL-23作為異源性二聚體蛋白，主要來源于活化的樹突細胞和巨噬細胞，且具有多種生物學功能。IL-23還可作用于分化成熟的Th17細胞，促進IL-17蛋白的分泌。研究報道顯示，膿毒癥患者血清IL-23水平明顯高于健康體檢者〔17〕。CRP主要由肝臟合成，其在機體出現嚴重損傷及感染時顯著上升，在炎癥刺激的4～6 h內，其水平可由于細胞因子刺激而顯著上升，在36～50 h達到最高峰。相關研究報道顯示，膿毒癥患者血清CRP水平顯著高于健康體檢者〔18〕。

microRNA在參與炎癥疾病病理生理過程及維持機體自身穩態等方面具有意義〔19,20〕。microRNA-155是近年來研究熱點，且認為其為膿毒癥炎癥網絡效應的平衡點參與病理生理過程，認為其能夠作為診斷診斷的一種敏感指標，且可為膿毒癥接受基因治療及免疫調理的重要靶點。研究報道顯示，體內microRNA-155表達與膿毒癥免疫失衡程度相關，且對膿毒癥病情程度具有一定預警作用〔21〕。而目前關于microRNA-466研究甚少。

本研究表明，TGF-β/Smad信號通路，炎癥因子PCT、IL-23和CRP及外周血microRNA-155和microRNA-466表達可能參與膿毒癥發生、發展，且與病情進展密切相關，有助于診斷和指導治療。