D-半乳糖/亞硝酸鈉誘導癡呆小鼠大腦海馬組織中CX43、MMP-2、MMP-9的mRNA及蛋白表達

黃仕美 楊小蓉 羅亞 汪忠保 汪元河

(1貴州醫科大學法醫學院法醫臨床學教研室，貴州 貴陽 550004；2貴州省黔西縣公安局)

老年性癡呆癥又叫阿爾茨海默病(AD)，該病的主要根源是神經退行性改變，此類患者在行為上會表現出記憶能力變差、智力退化、性格和精神失常、與社會環境格格不入〔1〕。在外觀上的表現為老年斑、因持續累積的tau 蛋白過度磷酸化形成的神經原纖維纏結(NFT)及β-淀粉樣蛋白(Aβ)增加〔2〕。該疾病的病因及怎樣有效預防和治療暫時還沒有達成共識。鋅依賴性肽鏈內切酶類中，對細胞外基質蛋白產生降解作用的是基質金屬蛋白酶(MMPs)，許多神經系統疾病，包括帕金森病(PD)及AD在內，其形成都與MMPs相關。該類酶將對應的細胞外基質(ECM)進行分解，在各類細胞的病理及生理活動中對重組及水解兩個過程的平衡進行作用。此外，在人體出現炎癥時，MMPs的作用也是不可或缺的〔3，4〕。從神經毒性來說，Aβ和誘導型一氧化氮合酶(iNOS)存在著極大關聯。不僅如此，Aβ代謝活動在AD 患者體內所維持的平衡狀態會隨相關金屬離子的狀態受 MMP-2作用產生的變化而發生改變，若AD所產生的作用存在于相關過程中，則該蛋白的活力水平必定會發生改變〔5〕。目前，基本上還沒有研究得出在AD的形成和治療過程中縫隙連接蛋白(CX)43和MMP-2、MMP-9的表達之間存在關聯。

1 材料和方法

1.1實驗動物 雄性NIH小鼠40只，16～24 g。貴州醫科大學實驗動物中心無特定病原體(SPF)級環境飼養，經實驗動物倫理委員會批準。

1.2試劑 D-半乳糖、亞硝酸鈉均為市售分析純；由上海生物工程有限公司設計生產MMP-9、CX43、MMP-2、β-actin定量聚合酶鏈反應(PCR)的引物；DL2000 DNA Marker購自日本TaKaRa公司；2×Taq PCR Master Mix購自北京TIANGEN 公司；Trizol試劑購自Invitrogen公司；Firststart Universal SYBR Green Master(Rox)購自德國Roche公司；RNA 逆轉錄試劑盒購自Thermo公司；聚偏氟乙烯(PVDF)膜和超敏電化學發光試劑盒購自美國Amer-sham公司；封閉液、抗體稀釋液、苯甲基磺酰氟(PMSF)蛋白酶抑制劑、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)配制試劑盒及5×蛋白上樣緩沖液購自上海碧云天生物技術有限公司；兔抗CX43單克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；兔抗MMP-2多克隆抗體、兔抗MMP-9多克隆抗體、兔抗β-肌紅蛋白(β-actin)單克隆抗體購自上海Santa Cruz公司。

1.3動物分組及藥物處理 小鼠隨機分為正常對照組和模型組各10只。正常對照組皮下注射等體積生理鹽水，模型組皮下注射D-半乳糖(120 mg/kg)和亞硝酸鈉(90 mg/kg)，連續給藥60 d，建立癡呆小鼠模型〔6〕。完成注射后，將4%的0.2 ml/g水合氯醛注射進腹腔進行麻醉，剖開胸面，露出心臟，由左心室一直延伸到主動脈用穿刺針穿刺，使用40 ml pH=7.4的磷酸鹽緩沖液(0.01 mol/L)清潔血管床，持續5 min接著剝離大腦組織，-80℃儲存。

1.4實時熒光(RT)-PCR檢測β-actin、MMP-9、MMP-2及CX43 mRNA表達水平 用Trizol一步法，提取海馬組織中RNA，逆轉錄成cDNA。β-actin、MMP-9、MMP-2及CX43對應的引物序列見表1。采用ABI Step One Plus 型RT-PCR儀獲取β-actin、MMP-9、MMP-2及CX43的擴增信號采用SDS2.1軟件對數據進行分析及對熒光信息進行獲取。β-actin為內參對照，對所得結果進行分析，RQ=2-ΔΔCt，該實驗重復3次。

表1 RT-PCR引物序列及產物片段

1.5Western印跡法檢測MMP-9、MMP-2及CX43蛋白表達水平 向PMSF：放射免疫沉淀(RIPA)裂解液=1∶100的比例放入海馬組織，冷凍離心機4℃、12 000 r/min離心20 min，取上清液檢測目標蛋白質。使用超微量紫外分光光度計N2000型檢測各樣品蛋白濃度，Image J軟件分析圖片灰度值，以β-actin蛋白為內參，MMP9、MMP2、CX43的蛋白條帶相對內參蛋白條帶灰度的比值為檢測蛋白的相對表達水平，重復3次。

1.6統計學處理 采用SPSS19.0軟件行t檢驗。

2 結 果

相比于正常對照組，模型組CX43、MMP-9 mRNA和蛋白表達水平均顯著升高(P<0.05，P<0.01)，見表2。

表2 兩組CX43、MMP-2、MMP-9 mRNA和蛋白表達水平

3 討 論

MMPs是一組降解細胞外基質最主要的酶類〔7〕，1962年，Lapiere和Gross首次發現，在多種內膚酶中存在著一系列根據鋅離子相關狀況來發揮功能的蛋白酶，也就是MMPs，除了神經元，還有許多不同類型的細胞都能夠分泌此類蛋白酶，如淋巴細胞、巨噬細胞、單核細胞、內皮細胞、血管平滑肌細胞及神經膠質細胞等〔8〕。一般來說，在人體傷口恢復和發育的過程中，MMPs所起到的作用是非常關鍵的，但若人體發生了某些疾病，MMPs所產生的作用對病情的發展十分不利，如AD或腦卒中等〔9，10〕。到目前為止，已有超過20種人體自帶的MMPs被發現〔11〕。

MMPs的種類較多，其中所起到的影響最大的就是能夠對層黏連蛋白、彈性蛋白及明膠等進行分解的MMP-2和MMP-9，在發生水解后，神經細胞會因層黏連蛋白的減少而遭到嚴重破壞甚至失活。研究表明，AD患者死亡后，解剖尸體發現MMP-9在大腦血管內皮細胞及海馬體神經元中呈高表達，因此神經細胞難以實現膠原化。而在腦組織細胞中，MMP-2、MMP-9 的高表達可促進細胞凋亡，損害神經元。Aβ屬于三磷酸腺苷(ATP)的分解產物，該物質的降解可通過MMP-9來實現，這一點在體外實驗中已經得到了驗證，此外，髓鞘堿性蛋白及細胞外基質也會在MMP-9的作用下被徹底分解，更加嚴重地破壞患者腦部組織〔8〕。信息交流在細胞中的實現主要依靠縫隙連接(GJ)，包括環磷酸腺苷(cAMP)、三磷酸肌醇(IP3)及ATP在內的部分小分子氨基酸等小分子物質及離子等能夠穿過其中，該結構由兩個半通道相連而成，主要物質為CX，其具有特殊性質。在血腦屏障精細結構的組成中CX43是組成星形膠質細胞縫隙的主要物質，該類結構多存在于中樞神經系統中。縫隙的信息交流水平極大程度上取決于CX43的表達程度，這一點在包括骨髓損傷在內的部分神經病理性疼痛模型中有所體現〔12〕。

雖然NFT及老年斑因Aβ沉積而增多是引發AD的關鍵原因，但AD是一個多因素相互作用的疾病〔13〕。本實驗結果提示CX43及MMP-9表達紊亂在AD小鼠的發病機制中可能起著重要作用。