姜黃素對阿爾茨海默病小鼠的治療作用

孫冬梅

(長春醫(yī)學高等專科學校基礎醫(yī)學部組胚教研室，吉林 長春 130031)

阿爾茨海默病(AD)是一種與年齡相關的神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性退行性病變，也是一種神經(jīng)毒性損傷病變〔1,2〕。臨床主要表現(xiàn)為進行性精神狀態(tài)衰變，包括記憶障礙、情感障礙、認知障礙及社交障礙等，發(fā)病近年呈上升趨勢〔3,4〕。目前西醫(yī)對AD尚無有效治療藥物且西藥長期服用副作用顯著〔1，5〕，因此本實驗研究采用姜黃素治療，探究姜黃素對AD小鼠記憶能力、腦組織神經(jīng)細胞損傷程度、凋亡程度、腦組織中β-淀粉樣(Aβ)和磷酸化tau(Ptau)蛋白的陽性表達強度及mRNA水平的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物來源及分組 實驗動物野生C57BL/6和轉(zhuǎn)基因APP/V717雌性小鼠，體質(zhì)量(23.4±1.2)g，由遼寧長生生物技術股份有限公司提供，合格證SCXK(遼)2015-0001。實驗分為對照組(C57BL/6野生雌性小鼠，n=10)、AD模型組(APP/V717轉(zhuǎn)基因雌性小鼠，n=10)和姜黃素治療組(APP/V717轉(zhuǎn)基因雌性小鼠，n=10)，三組均給予正常飲食。

1.2實驗試劑及儀器設備 姜黃素購于上海遠慕生物科技公司；鼠抗Aβ和Ptau蛋白抗體購于Abcam公司；SP9710和二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒購于福州邁新生物技術有限公司；Tunnel熒光凋亡試劑盒購于長春鼎國生物有限公司；Trizol購于Invitrogen公司；Taq酶、DL 2000 marker和RT-PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于塔克拉公司；引物由上海生物工程有限公司提供。實時熒光定量PCR儀(ABI7300，Biotek公司，美國)；Biometra PCR擴增儀(Biotek公司，美國)；Morris水迷宮(Panlab公司，西班牙)；OLYMPUS BX51和BX53顯微鏡(OLYMPUS公司，日本)。

1.3給藥方式和劑量 對照組和模型組每天灌胃一次生理鹽水0.1 ml，姜黃素治療組每天灌胃一次姜黃素0.1 ml(50 mg/kg)，共治療8 w。

1.4實驗標本采集和檢測指標

1.4.1各組小鼠記憶能力 在實驗結束前5 d，通過Morris水迷宮連續(xù)訓練4 d，第5天測試潛伏期，觀察小鼠記憶能力是否有改善。

1.4.2各組小鼠腦組織神經(jīng)細胞損傷程度 三組小鼠在治療12 w結束后，處死取腦組織，常規(guī)石蠟包埋，制備3.5 μm切片4張，一張通過蘇木素-伊紅(HE)染色普通光學顯微鏡下觀察腦組織神經(jīng)細胞損傷程度及攝取圖片。

1.4.3各組小鼠腦組織神經(jīng)細胞凋亡程度 3.5 μm石蠟切片一張，通過Tunnel染色熒光顯微鏡下觀察腦組織神經(jīng)細胞凋亡程度及攝取圖片，連續(xù)觀察200倍5個視野，計數(shù)神經(jīng)細胞凋亡百分率。

1.4.4各組小鼠腦組織中Aβ和Ptau mRNA水平 Trizol提取腦組織總RNA，每個樣本基因擴增3次，行實時熒光定量PCR檢測Aβ和Ptau mRNA水平，取Ct值均值，采用2-ΔΔCt表示目的基因相對表達水平。

1.4.5各組小鼠腦組織中Aβ和Ptau蛋白陽性表達強度 3.5 μm石蠟切片兩張，分別通過免疫組織化學染色觀察Aβ和Ptau蛋白陽性表達強度，陽性表達呈棕黃色斑塊，細胞核用蘇木精復染為藍色。通過連續(xù)觀察200倍5個視野，計數(shù)陽性斑塊。

1.5統(tǒng)計學分析 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1各組Morris水迷宮測試潛伏期比較 與對照組比較，模型組潛伏期明顯延長(P<0.05)；姜黃素治療組潛伏期略延長(P>0.05)，但較模型組明顯縮短(P<0.05)，見表1。

2.2各組腦組織神經(jīng)細胞損傷程度比較 HE染色可見對照組小鼠腦組織無神經(jīng)胞損傷，姜黃素治療組小鼠腦組織神經(jīng)細胞固縮壞死較模型組明顯減輕，見圖1。

2.3各組腦組織神經(jīng)細胞凋亡程度比較 Tunnel染色可見姜黃素治療組小鼠腦組織神經(jīng)細胞凋亡數(shù)量較模型組明顯減少，較對照組略有增多；通過連續(xù)觀察200倍5個視野，計數(shù)凋亡細胞百分率差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)；見圖2，表1。

表1 各組Morris水迷宮潛伏期、腦組織中神經(jīng)細胞凋亡百分率及Aβ和Ptau蛋白陽性斑塊數(shù)比較

與對照組比較:1)P<0.05；與模型組比較:2)P<0.05

圖1 各組腦組織病理學觀察(HE，×200)

圖2 各組腦組織Tunnel染色(×200)

2.4各組腦組織Aβ和Ptau mRNA水平比較 實時熒光定量PCR檢測可見姜黃素治療組小鼠腦組織中Aβ mRNA(9.38±2.24)和Ptau mRNA(7.53±2.39)水平均較模型組Aβ mRNA(27.56±6.19)和Ptau mRNA(16.86±6.47)明顯降低，較對照組Aβ mRNA(3.12±0.98)和Patu mRNA(2.09±0.82)略有增多,差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。

2.5各組腦組織中Aβ和Ptau蛋白陽性表達強度比較 免疫組織化學染色可見姜黃素治療組小鼠腦組織中Aβ和Ptau蛋白陽性表達強度均較模型組明顯降低，較對照組略有增多；通過連續(xù)觀察200倍5個視野，計數(shù)陽性斑塊差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)，見圖3，表1。

圖3 各組腦組織Aβ、Ptau蛋白免疫組織化學染色(DAB，×200)

3 討 論

隨著社會進步人口老齡化、生活壓力及日常不良生活習慣的增加，AD死亡率和發(fā)病率都在逐年的上升〔6,7〕。姜黃素是從草本植物姜黃根莖中提取出的一種多酚類化合物，以往研究表明姜黃素具有較好的生理活性，能夠降血脂、抗炎、抗腫瘤、清除自由基及在癡呆領域里有著潛在意義〔2，8〕。本實驗結果表明姜黃素在提高AD小鼠空間學習記憶能力方面作用顯著。

AD的病理基礎是Aβ在腦組織神經(jīng)元細胞外的異常沉積和tau蛋白Ptau增多引起的神經(jīng)纖維纏結〔9,10〕。Aβ和Tau蛋白的異常，尤其是Tau蛋白的異常與AD發(fā)病機制緊密相關〔11〕。Aβ是一種神經(jīng)毒性物質(zhì)，它可引起氧化應激，刺激腦組織產(chǎn)生4-羥基壬烯酸和過氧化氫(H2O2)，導致神經(jīng)細胞凋亡；Aβ的沉積會形成老年斑，老年斑中的大量銅、鐵等金屬離子與Aβ作用又產(chǎn)生H2O2，進一步介導AD患者腦組織的氧化損傷〔12〕。Tau蛋白在神經(jīng)退行性病變的誘導中最為關鍵，它與細胞有絲分裂、細胞內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運有關，是一種微管相關蛋白，通常以磷酸化和去磷酸化兩種形式存在，二者保持平衡狀態(tài)〔3，13～15〕；Tau蛋白位于17染色體長臂，是一種磷酸基蛋白，通常含有2～3個磷酸基，當Tau蛋白異常過度磷酸化時常含有5～9個磷酸基，喪失刺激微管聚集的生物學功能成為毒性分子，這些過度磷酸化的Tau蛋白破壞正常微管系統(tǒng)，自身聚集形成神經(jīng)纖維纏結，引起神經(jīng)元功能損傷發(fā)生腦神經(jīng)退行性病變〔16,17〕。本實驗結果表明姜黃素能顯著提高AD小鼠空間學習記憶能力；它可能通過降低腦組織神經(jīng)細胞凋亡程度及Aβ和Ptau基因水平對AD小鼠具有明顯的治療效果，其作用機制和作用通路有待于進一步探討。