高血壓腎損害患者IL-6-572、IL-6-174基因多態性及其與貝那普利治療反應的相關性

于欣 張德凱 楚元奎 張怡清 白靜 邢譯文 楊震

1寧夏醫科大學臨床學院醫學檢驗系（銀川750004）；2寧夏醫科大學總醫院心臟中心（銀川750004）

高血壓腎病的主要病理學改變為炎癥、腎小球硬化和間質纖維化［1］。免疫細胞，尤其是單核/巨噬細胞發揮重要作用［2-3］。有研究［4-7］表明高血壓腎損害與免疫炎癥相關。本團隊先前的研究顯示高血壓腎損害患者血清腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）和白細胞介素-6（interleukin 6，IL-6）水平升高［8］，提示炎癥因子和炎癥反應在其中扮演重要角色。

既已知炎癥和免疫在高血壓腎損害中發揮重要作用，而細胞因子IL-6是炎癥和免疫反應的重要介質，受IL-6 基因多態性的調控，其中IL-6-572 和IL-6-174 基因是調控的重要位點，那么高血壓腎損害的發生是否與IL-6-572和IL-6-174的基因多態性相關目前鮮有研究。本研究探討高血壓腎損害與IL-6-572、IL-6-174 基因型的關聯，及其不同基因型對貝那普利治療的反應，擬通過IL-6基因多態性檢測篩選高血壓腎損害的高危人群，并為高血壓腎損害患者精準選擇降壓藥物提供指導。

1 對象與方法

1.1 研究對象選取2013年1月至2015年12月于寧夏醫科大學總醫院就診的初診高血壓患者284 例，其中男170 例，女114 例，平均年齡（52 ± 11）歲。測定24 h 尿蛋白排泄率（urinary albumin excretion rate，UAER），分為高血壓組（UAER ＜20 μg/min）和高血壓腎損害組（UAER ≥20 μg/min）。高血壓診斷標準：收縮壓（systolic blood pressure，SBP）≥140 mmHg 和（或）舒張壓（diastolic blood pressure，DBP）≥90 mmHg。高血壓腎損害診斷標準：高血壓病史合并UAER ≥20 μg/min，除外慢性腎小球腎病（有腎小球疾病史，可以伴發高血壓，但常于腎損害后發生）和糖尿病腎病（先有糖尿病史，后出現腎損害）等腎臟疾病。排除標準：有繼發性高血壓，以及合并感染、腫瘤、肝病、代謝及免疫等相關疾病的患者。同時選取160 健康體檢者作為正常血壓組，其中男94例，女66例，平均年齡（52±12）歲。貝那普利作為高血壓腎損害患者的基礎降壓藥物，10 mg，1 次/d，依據血壓水平及臨床特點酌情加用鈣拮抗劑（calcium channel blockers，CCBs）、β 阻滯劑（β blockers）、血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑（angiotensin Ⅱreceptor blockers，ARBs）、利尿劑。16 周后復查IL-6 及UAER 評價療效。

1.2 UAER 測定留取24 h 尿（7：00-次日7：00），混勻后取5 mL 離心，取上清液用放免法測定尿白蛋白，計算UAER（μg/min）。間隔1 周以上重復測定一次，取均值作為最后結果。

1.3 血液標本的采集空腹8 h 后清晨取靜脈血于抗凝管中離心，取血漿檢測總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein-cholesterol，LDL-C）和IL-6。取白細胞層加入紅細胞裂解液，白細胞沉淀行DNA 提取。IL-6 濃度采用酶聯免疫檢測法（美國RB 公司）。

1.4 基因多態性檢測制備DNA 模板后采用限制性片段長度多態性聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction - restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）檢測。引物序列：IL-6-572：上游5′-GGAGACGCCTTGAAGTAACTGC-3′，下游5′-GAGTTTCCTCTGACTCCATCGCAG-3′。IL-6-174：上游5′-TGACTTCAGCTTTACTCTTTGT-3′，下游5′-CTGATTGGAAACCTTATTAAG-3′。PCR 擴增體系：預變性94 ℃3 min，94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸200 s，35 次循環，完成后于72 ℃延伸5 min。擴增片段長度分別為163 和198 bp。然后以2%瓊脂糖凝膠進行水平電泳，然后行BsrBⅠ和NlaⅢ限制性內切酶酶切鑒定。

1.5 統計學方法用SPSS 13.0 進行分析，計量資料以（）表示，計數資料以頻數和百分比（%）表示。Hardy-Weinberg 平衡法檢測樣本的群體代表性。多組間比較采用方差分析。計數資料的比較及各基因型頻率分布和等位基因頻率分布的比較采用χ2檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般資料3 組間年齡、性別、體質量指數（body mass index，BMI）、TG 比較無差異（P＞0.05）。高血壓組和高血壓腎損害組SBP、DBP、TC、LDL-C和IL-6 均高于正常血壓組（P＜0.05）。高血壓組和高血壓腎損害組間比較，高血壓腎損害組IL-6高于高血壓組（P＜0.05），其余指標差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組間一般指標比較Tab.1 The basic parameters in difference groups ±s

表1 各組間一般指標比較Tab.1 The basic parameters in difference groups ±s

注：與正常血壓組比較，aP ＜0.05；與高血壓組比較，bP ＜0.05

組別正常血壓組高血壓組高血壓腎損害組P值例數160 152 132年齡（歲）52±12 53±10 51±11 0.385男/女（例）94/66 90/62 80/52 0.947 BMI（kg/m2）22±5 25±6 23±5 0.645 SBP（mmHg）124±12 155±18a 154±15a＜0.001 DBP（mmHg）81±9 98±10a 97±11a＜0.001 TC（mmol/L）3.76±1.13 5.34±1.01a 5.49±0.99a＜0.001 TG（mmol/L）1.86±0.88 1.96±1.15 1.99±0.92 0.865 LDL-C（mmol/L）2.03±0.65 2.97±0.98a 3.04±0.87a＜0.001 IL-6（ng/L）234±45 354±52a 436±65ab＜0.001

2.2 IL-6-572 和IL-6-174 基因多態性分布3 組的IL-6-572 基因型頻率均符合Hardy-Weinberg 平衡（P＞0.05）。高血壓腎損害組中，CG 和GC 分別是IL-6-572 和IL-6-174 占比最高的基因型。3 組間IL-6-572G/C 和IL-6-174C/G 等位基因頻率比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

2.3 高血壓腎損害患者IL-6-572 和IL-6-174 不同基因型間臨床特征的比較結果顯示，IL-6-572CG基因型和IL-6-174GG 基因型患者的TC、LDL-C 及IL-6 水平最高，方差分析結果顯示差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表2 各組間IL-6-572 和IL-6-174 基因多態性比較Tab.2 The genotypes of IL-6-572 and IL-6-174 in different groups 例（%）

2.4 高血壓腎損害患者不同IL-6-572和IL-6-174基因型對貝那普利治療的反應IL-6-572 和IL-6-174 3 種基因型間在降壓藥物的應用方面差異無統計學意義（P＞0.05）。治療16 周后復測UAER 和IL-6結果顯示，IL-6-572 GG 基因型、IL-6-174 CC 基因型治療后反應最佳，治療前后UAER 和IL-6的改變幅度最大（P＜0.05）。而方差分析顯示3 組間血壓下降幅度差異無顯著性（P＞0.05），見表4、5。

3 討論

IL-6-572 和IL-6-174 基因都位于IL-6 基因啟動子區域。BRULL 等［9］研究表明，L-6 啟動子-572C/G 多態性是IL-6 基因調控的關鍵點，而IL-174 基因與系統性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）相關［10］。IL-6-572 基因型變化可能影響其轉錄活性和在外周血中的表達。有研究［11］表明IL-6-572、IL-6-174 基因多態性與風濕性心臟病相關，張文靜等［12］研究發現IL-6-572C/G 位點基因多態性與慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）易感性有關聯，而COPD 患者IL-6 水平顯著升高［13］。但目前少有研究探索IL-6-572、IL-6-174 多態性與高血壓及高血壓腎損害之間的關聯。

表3 高血壓腎損害患者IL-6-572、IL-6-174 各基因型的臨床特征比較Tab.3 The clinical characteristics of the hypertensive renal damage subsets with different IL-6-572 and IL-6-174 genotypes±s

表3 高血壓腎損害患者IL-6-572、IL-6-174 各基因型的臨床特征比較Tab.3 The clinical characteristics of the hypertensive renal damage subsets with different IL-6-572 and IL-6-174 genotypes±s

注：與IL-6-572CG 基因型比較，aP ＜0.05；與IL-6-572CC 基因型比較，bP ＜0.05；與IL-6-174GG 基因型比較，cP ＜0.05；與IL-6-174GC 基因型相比較，dP ＜0.05

例數年齡（歲）BMI（kg/m2）SBP（mmHg）DBP（mmHg）TC（mmol/L）TG（mmol/L）LDL-C（mmol/L）IL-6（ng/L）IL-6-572 CG 70 51±12 24±5 154±14 95±10 6.12±1.09 2.02±0.89 3.83±0.70 533±76 CC 42 50±10 23±6 156±13 97±10 5.11±0.97a 2.15±0.96 2.74±0.71a 421±66a GG 20 53±12 25±4 153±15 96±11 4.59±0.87ab 2.14±1.07 2.37±0.64ac 391±50ab P 值0.145 0.369 0.586 0.254 0.000 0.547＜0.001＜0.001 IL-6-174 GG 68 52±11 23±5 152±13 96±10 6.10±1.10 2.00±1.00 3.40±0.82 531±75 GC 44 51±10 21±6 150±15 94±11 5.14±0.98c 2.02±0.92 2.74±0.95c 423±68c CC 20 54±12 24±4 156±15 99±11 4.76±0.97cd 2.16±1.10 2.67±0.65cd 387±54cd P 值0.672 0.624 0.341 0.273 0.033 0.435 0.041 0.015

表4 高血壓腎損害組IL-6-572、IL-6-174 各基因型服用降壓藥物比較Tab.4 The antihypertensive drugs in hypertensive renal damage patients with different IL-6-572 and IL-6-174 genotypes 例（%）

本研究發現，單純高血壓患者和高血壓腎損害患者相比，IL-6-174、IL-572的基因型存在差異，而不同基因型之間IL-6的濃度水平也存在差異，這種基因多態性使得不同患者在相同的血壓水平，IL-6的濃度水平可能不同，對腎臟產生不同程度的影響［14］。

表5 高血壓腎損害不同IL-6-572、IL-6-174 各基因型對貝那普利的反應Tab.5 The therapeutic responses to benazepril in hyertensive renal damage subsets with different IL-6-572 and IL-6-174 genotypes±s

表5 高血壓腎損害不同IL-6-572、IL-6-174 各基因型對貝那普利的反應Tab.5 The therapeutic responses to benazepril in hyertensive renal damage subsets with different IL-6-572 and IL-6-174 genotypes±s

注：與IL-6-572CG 基因型比較，aP ＜0.05；與IL-6-572CC 基因型比較，bP＜0.05；與IL-6-174GG 基因型比較，cP ＜0.05；與IL-6-174GC 基因型相比較，dP ＜0.05

例數△SBP（mmHg）△DBP（mmHg）△UAER（μg/min）△IL-6（ng/L）IL-6-572 CG 70 24±9 18±12 39±36 81±62 CC 42 28±10 21±10 73±34a 138±66a GG 20 25±13 20±11 108±48ab 220±106ab P 值0.234 0.146 0.000 0.000 IL-6-174 GG 68 25±10 19±10 41±38 77±65 GC 44 31±12 22±12 78±67c 143±76c CC 20 29±13 20±10 112±98cd 223±126cd P 值0.346 0.158＜0.001＜0.001

炎癥和免疫，尤其是細胞因子IL-6 在高血壓腎損害中的作用在近年來得到越來越多的研究證實［15］。在慢性腎病（chronic kidney disease，CKD）患者的腎組織中，IL-6 濃度升高，如果患者伴有顯著的血壓升高，那么IL-6的升高更為顯著。本課題組前期研究顯示高血壓腎損害患者IL-6 升高［8］，表明高血壓腎損害時，IL-6 在腎內和外周都升高。而另外的研究［15］發現鹽敏感性大鼠的高血壓腎損害在經過IL-6的特異性中和抗體干預處理后，能夠得到顯著減輕，從側面證實了IL-6 在高血壓腎損害中的作用。

IL-6的腎損害作用與血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，Ang Ⅱ）密切相關。作為AngⅡ信號傳遞過程中的重要因子，IL-6 在AngⅡ介導的纖維化相關基因和原內皮素-1（prepro-ET-1）mRNA 在腎臟的表達中發揮著重要作用，而這兩種基因的過度表達能夠誘導腎纖維化和腎損害。小鼠實驗中，經過AngⅡ灌注處理后，IL-6 水平升高，如敲除IL-6基因，則血壓顯著下降，且由AngⅡ介導的腎損害和腎纖維化也會明顯減輕，提示IL-6 是高血壓和高血壓腎損害的重要介質［15］。

本研究結果還顯示，兩個病例組的TC和LDL-C水平都較正常對照組升高。在高血壓腎損害組內，IL-6-572、IL-6-174 不同基因型的TC 和LDL-C水平不同，不同基因型的IL-6 水平也存在差異，提示TC 和LDL-C 可能與IL-6 之間有著某種關聯，但這種關聯的機制目前報道較少。

已知高血壓腎損害的發生與IL-6 基因多態性關聯，不但可以檢測IL-6 基因型來評估高血壓患者發生腎損害的風險，而且在選擇藥物時，可以根據IL-6 基因型在高危患者中優先選擇有腎臟保護作用的降壓藥，如貝那普利等，以期延緩高血壓腎損害的進展。

另外，本研究還探討了高血壓腎損害患者IL-6 各基因型對貝那普利的反應。通過檢測治療后UAER 和IL-6 水平的變化，發現對貝那普利的療效與IL-6 基因型相關，檢測IL-6-572 和IL-6-174基因型可預測高血壓腎損害患者對貝那普利的療效，對藥物的合理篩選具有指導作用。

本研究的新穎之處在于揭示了IL-6-572 和IL-6-174 基因多態性與高血壓腎損害及其與貝那普利治療反應的關聯，不足之處在于研究對象的范圍較為局限，對慢性腎病和估算腎小球濾過率（eGFR）＜60 mL/（min·1.73 m2）的患者的腎功能損害與IL-6-572 和IL-6-174 基因多態性的相關性未能進行探討，這也是下一步研究的方向。