整合定性策略用于大黃素代謝物的高通量靶向鑒定

蔡芳 任繁棟 任達兵 劉韶 易倫朝

摘 要：采用超高效液相色譜四極桿軌道阱質譜聯用技術，使用Thermo scientific Hypersil GLOD色譜柱，以0.1%甲酸乙腈為流動相，應用梯度洗脫程序對腎間質纖維化大鼠血清中的大黃素及其代謝物進行了分析。將質量虧損、中性丟失、診斷碎片離子過濾等技術互相融合，提出了一種可高通量靶向鑒定藥物有效成分在體內的代謝物的方法，并將本方法應用到大黃素大鼠血液代謝物的鑒定中，鑒定出大黃素在大鼠體內的11種代謝物及39種可能的代謝物，并證明大黃素在大鼠體內的Ι相代謝途徑主要是氧化和羥基化，Ⅱ相代謝途徑主要是硫酸酯化和葡萄糖醛酸化。本方法有效減少了定性分析過程中基質和干擾離子的影響，提高了代謝物定性分析的效率和準確性。

關鍵詞：超高效液相色譜高分辨質譜聯用技術; 質量虧損; 診斷碎片離子; 中性丟失; 大黃素

1 引 言

超高效液相色譜高分辨質譜聯用技術（Ultra high performance liquid chromatographyhigh resolution mass spectrometry， UPLCHRMS）作為一種強大的分析工具，可為化合物的結構鑒定提供豐富的信息[1，2]。 然而，由于數據的高復雜度，也給高通量靶向鑒定目標代謝物帶來困難。同時，目標代謝物分析過程中容易受到其它代謝物或基質的干擾，甚至在某些情況下，干擾離子的強度遠高于真正的質譜特征，從而難以從原始數據中快速鑒定目標化合物，增加了代謝物的定性分析的難度。

目前，UPLCHRMS數據處理的策略主要有質量虧損過濾（Mass defect filtering， MDF）、氮規則過濾（Nitrogen rule filtering， NRF）、中性丟失過濾（Neutral loss filtering， NLF）和診斷碎片離子過濾（Diagnostic fragment ion filtering， DFIF）等。質量虧損是指在核形成和穩定時，不同的元素或其同位素需要吸收或釋放不同的能量，進而導致能量發生變化。簡言之，即是一種元素或者化合物的精確質量與其最接近整數值之間的差值[3]。質量虧損過濾可以有效地凈化色譜圖，排除期望質量范圍外的化合物，降低質譜解析的復雜度[4]。然而，僅采用質量虧損過濾很難全面地過濾干擾離子。診斷碎片離子過濾的方法是基于具有相同或相似骨架的化合物在相同的碰撞電壓下會有相似的質譜裂解，產生相似的碎片信息而提出的。這種方法有助于物質裂解規律的推測[5]。物質在裂解過程中，會失去一些不帶電荷的基團，例如CH3、SO3、H2O等。這些中性丟失信息有助于推測物質發生的反應類型、取代基的種類及其質譜裂解規律，可快速、有效地為物質發生的代謝反應提供合理的證據，但是，不能推測化合物的主體結構信息[6]。質量虧損過濾可有效地凈化譜圖，篩選已知與未知化合物信息; 中性丟失過濾有助于了解化合物的裂解規律及官能團特征; 診斷碎片離子過濾可以篩選具有相同骨架的化合物。單一過濾策略常難以避免定性分析過程中的假陽性和假陰性。整合多種過濾方法可在高通量定性分析多種化合物的同時，提高定性效率和準確性，有望成為高通量靶向定性分析的有效方法。

大黃是蓼科植物掌葉大黃、唐古特大黃及藥用大黃的干燥根或干燥莖[7]。大黃中含有蒽醌類、蒽酮類、二苯乙烯類、鞣質類、有機酸等化合物。大黃素是大黃中的重要活性成分，也是藥效物質基礎標志物之一[8，9]。本研究僅以大黃提取液中的大黃素為研究對象，采用整合定性分析策略對其在血液中的Ⅰ相代謝物和II相代謝物進行高通量靶向篩選和定性分析，并以此為例說明整合定性分析策略高通量靶向篩選、定性分析代謝物的過程和有效性。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

UltiMate 3000超高效液相色譜儀、Q Exactive臺式四極桿軌道阱高分辨質譜（美國Thermo Scientific公司）; MXF微型渦旋混合器（上海偉進生物科技有限公司）; MilliQ A10超純水機（德國Merck公司）。

乙腈、甲醇（質譜純，德國Merck公司）; 甲酸（色譜純，SigmaAldrich公司）; 大黃素（Lot code： 151008）、大黃酸（Lot code： 150528），純度>98%（上海源葉生物科技有限公司）。

2.2 實驗方法

2.2.1 大黃單煎液的制備 取18 g大黃藥材，加入10倍量的蒸餾水加熱回流1.5 h，傾出提取液后，藥渣用8倍量的水再加熱回流提取1 h，合并兩次煎液，濃縮至100 mL。

2.2.2 動物實驗 SPF級SD雄性大鼠40只（6～8周齡，體重： 180～220 g），生長狀態良好，購自長沙斯萊克實驗動物有限公司。大鼠飼養于溫度為（22±2）℃， 相對濕度55%±2%，清潔無菌的環境中，每天給予12 h光照。所有大鼠自由采食、自由飲水。大鼠適應性喂養一周后，對其進行稱重、編號，并根據體重采用隨機區組設計對大鼠進行分組，共3組： 假手術組（16只），UUO模型對照組（14只），大黃提取物干預組（10只）。所有大鼠飼養于中南大學動物部大鼠房。實驗均嚴格按照中南大學動物管理委員會的管理條例使用和處理動物。大鼠在手術前一天下午禁食。

UUO大鼠模型制備： 手術前稱量并記錄每只大鼠的體重，根據體重計算（按0.35 mL/100 g計算）所需麻藥（10%水合氯醛溶液）劑量，進行腹腔麻醉。將大鼠脊柱及左側約4 cm×6 cm大小的區域剃毛備皮，絡合碘消毒; 在肋脊角下、脊柱左側做長約1.5 cm的縱行切口，分離肌肉，并剪開腹膜，暴露出左側腎臟，剝離腎蒂周圍脂肪與筋膜，分離輸尿管，于緊靠腎盂處及離腎盂約1.5 cm處結扎輸尿管，并從中間剪斷; 逐層縫合組織與皮膚。

給藥： 自手術當天大鼠麻醉蘇醒后，連續14天灌胃。干預組給予大黃單煎液灌胃，灌胃體積： 1 mL/100 g。 模型組灌胃生理鹽水。每日定時灌胃給藥，并觀察大鼠情況。

采血： 大鼠處死前24 h禁食，腹腔麻醉后心臟采血，血清樣本置于80℃保存。

2.2.3 大黃代謝物的檢測 （1）血清樣品的制備 樣品解凍后，取大黃提取物干預組大鼠血清樣本300 μL于離心管中，加入1200 μL乙腈去蛋白，渦旋1 min后，在4℃下14500 r/min離心10 min。取上清液，常溫下氮氣吹干，再加入150 μL甲醇復溶，渦旋1 min后，在4℃下14500 r/min，離心10 min。取上清液置于進樣瓶中待進樣。（2）液相分離條件 色譜柱為Thermo scientific Hypersil GLOD （100 mm×2.1 mm ID，1.9 μm）分析柱。流動相A為乙腈，流動相B為0.1%甲酸，梯度洗脫： 0～4.0 min，5%～15% B; 4.0～8.0 min，15%～25% B; 8.0～14.0 min，25%～30% B; 14.0～16.0 min，30%～33% B; 16.0～22.0 min，33%～45% B; 22.0～23.0 min，45%～55% B; 23.0～25.0 min，55%～60% B; 25.0～28.0 min，60%～90% B; 28.0～29.0 min，90%～5% B; 29.0～30.0 min，5% B。柱溫： 35℃，流速： 0.2 mL/min，進樣量2 μL。（3）質譜條件 HESI離子源離子化模式： 負離子模式; 掃描模式： full MS （resolution 35000） 和 MS/MS （resolution 17500）; 掃描范圍： m/z 100～1000; 噴霧電壓： ×3.2 kV; 毛細管溫度： 320℃; 鞘氣壓力： 3 MPa; 輔助氣壓力： 0.8 MPa; 探針（Probe）溫度： 350℃; SLens RF level： 50; 碰撞能量： 25、35和50 eV。

2.3 數據處理過程

首先，采用MZ mine2.32軟件對UPLCHRMS數據進行色譜峰的構建、解卷積及分子式的預測等處理[10，11]。然后，通過數據轉換軟件MS convert將其轉換為.mzXML格式的數據，并運用RStudio1.0.44運行自編的R語言腳本文件對提取到的數據進行質量虧損過濾、中性丟失、診斷碎片離子過濾，以縮小代謝物的鑒定范圍[12]。最后通過數據庫（HMDB、Scifinder、Chemspider、MassBank）匹配、查閱參考文獻，實現大黃素代謝物的定性分析。其數據處理的流程如圖1所示。

3 結果與討論

3.1 質量虧損過濾分析

藥物在體內經過Ι相和Ⅱ相生物轉化后，其性質會發生變化，但藥物的核心結構不會發生徹底的改變。因此，藥物代謝物的質量虧損與藥物原型成分的質量虧損值相似[13，14]。大黃素在體內可能發生的Ι相和Ⅱ相反應的質量數變化及其質量虧損值如電子版文后支持信息表S1所示。根據文獻報道，大黃素在大鼠體內的代謝途徑主要包括氧化、羥基化、硫酸酯化和葡萄糖醛酸化[15，16]。本研究以大黃素的母體結構為Ι相反應的模板分子，大黃素發生硫酸酯化、葡萄糖醛酸化后的產物為Ⅱ相反應的主要模板分子，并基于大黃素在體內可能發生的代謝途徑及其代謝后物質的質量變化，設定了3個不同的質量虧損窗口。質量虧損窗口的設定是影響質量虧損過濾效果的關鍵因素，窗口設定范圍過大會導致非目標代謝物的干擾，而窗口設定范圍太小又將會使目標代謝物被過濾掉。本研究中質量虧損范圍主要依據大黃素在體內可能發生的Ι相代謝反應出現的最大分子量的變化確定。Ι相反應質量變化最大的是3次羥基化（見電子版文后支持信息表S1），質量變動47.9847 Da，因此，將3個模板分子的質量范圍設定為模板整數值加減48 Da。其質量虧損窗口的設定結果如表1所示。根據設定的質量虧損窗口，從UPLCHRMS獲得的13115個質譜碎片中篩選出344種可能與大黃素代謝有關的代謝物，有效地去除了背景離子的干擾，縮小了定性分析的范圍。

3.2 中性丟失過濾分析

化合物在裂解過程中會失去一些不帶電荷的基團，如CH3、CO、CO2、H2O、CHO和O等，即中性丟失。基于大黃素的結構特點，并查閱相關文獻[15，17～19]，分析大黃素在體內的代謝途徑（如電子版文后支持信息圖S1所示），運用R studio軟件運行自編的R腳本文件對數據進行中性丟失過濾，其過濾結果如表2所示。

單一的中性丟失過濾得到的質譜干擾信息仍然較多，且不能準確地定性分析出目標化合物。因此，在質量虧損過濾的基礎上，選擇出現頻率較高且具有代表性的中性丟失進行過濾，其過濾結果如圖2所示。結合質量虧損過濾和中性丟失過濾有效地縮小了質譜定性分析的范圍，減少了定性分析過程中非靶向代謝物的干擾，同時也有助于下一步代謝物裂解規律的總結和代謝物結構的推斷。通過中性丟失過濾與質量虧損過濾策略的有效結合，本研究從55個質譜碎片中篩選出36種可能的代謝物。

3.3 診斷碎片離子過濾及物質的定性分析分析

為了排除質量虧損過濾與中性丟失過濾過程中的假陽性結果，運用診斷碎片離子過濾對原始數據進行篩選，結合質量虧損過濾與中性丟失過濾的結果對36種可能的代謝物進行進一步的篩選。診斷碎片離子的確定主要基于大黃素在體內轉化生成其它游離型的蒽醌類物質（大黃酚、大黃酸及蘆薈大黃素），及其在代謝過程中母體結構不會發生改變，且裂解規律相似的原理[15，20，21]。本研究對大黃素代謝物的裂解情況和規律進行了總結和歸納，確定了大黃素代謝物的診斷碎片離子，其診斷碎片離子的結構及其相互轉化后的代謝物的裂解規律，如電子版文后支持信息圖S2所示。

進一步篩選診斷碎片離子，定性分析出了11種代謝物，主要是大黃素經Ι相反應（主要是氧化、羥基化、去甲基化）和Ⅱ相反應（主要是葡萄糖醛酸化和硫酸酯化）的產物，或者是經Ι相反應再經Ⅱ相反應的產物，這與文獻＼[15，22＼]報道大黃素的Ⅱ相反應主要是葡萄糖醛酸化和硫酸酯化一致，其定性分析結果如表3所示，其可能的結構如電子版文后支持信息圖S3所示。診斷碎片離子過濾有效排除了定性分析過程中的假陽性。造成這些代謝物的假陽性主要是由于同一類化合物的裂解具有相似的規律，而一些分子質量大的代謝物會產生與小分子質量代謝物相同的碎片信息，因此將一些分子質量大的代謝物的碎片定性分析為一種代謝物。

基于文獻報道的信息、大黃素可能發生的Ι相反應及其分子式改變的情況（如電子版文后支持信息表S1所示），預測其代謝物可能的分子式，通過準確質荷比信息，提取不同質荷比的一級質譜圖，并判斷其峰形，然后對比文獻報道的信息，對沒有二級質譜的物質進行定性分析。最后從一級質譜中初步定性分析出39種代謝物，其定性分析結果如表4所示，其可能的結構如圖3所示。

4 結 論

整合定性分析策略有效減少了質譜定性分析過程中干擾離子的影響，提高了準確定性分析的覆蓋率，減少了定性分析過程中的假陽性。但是，由于一些代謝物的質譜信息缺失，如沒有二級質譜，無法對其進行準確定性分析。為了實現更多代謝物的準確定性分析，應對UPLCHRMS的數據采集方式、質譜參數等進行優化，使更多的代謝物離子化，擴大檢測的范圍，使代謝物產生豐富的二級質譜。 同時，為了更有效地運用本方法進行靶向代謝物的定性分析，應充分了解代謝物的類型、結構特點及其在體內或者體外的轉化途徑，合理有效地運用不同的質譜過濾器，實現代謝物的準確定性分析。

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