黔產青錢柳中總三萜類化合物的含量測定方法優化及其產地加工研究

王維　葉世蕓　殷少文　鄭立肯

摘要?[目的]測定黔產青錢柳在不同炮制溫度及不同生長年限下總三萜含量的變化，以確定青錢柳產地加工的最佳溫度和生長年限對其品質影響的差異。[方法]通過正交試驗，樣品用30倍量的70%乙醇，超聲提取40?min，顯色后，在546.5?nm的波長下測定其吸光度。以齊墩果酸為標準品，測定其總三萜的含量。[結果]齊墩果酸濃度在0.004?1～0.024?6?mg/mL與吸光度呈良好的線性關系（r=0.999?7），平均加樣回收率為99.55%，RSD為2.24%（n=6），該方法可靠。不同干燥溫度和生長年限對黔產青錢柳中總三萜含量的影響具有顯著差異，干燥溫度在80?℃時，總三萜的含量高于其他炮制溫度下的，并且高溫和低溫條件下，青錢柳的色澤加深，影響到成品的外觀性狀。[結論]青錢柳的最佳干燥溫度為80?℃，由于不同生長年限中總三萜含量的差異無規律可尋，有待進一步研究確定。

關鍵詞?青錢柳;干燥溫度;生長年限;總三萜;紫外分光光度法;產地加工

中圖分類號?R284文獻標識碼?A

文章編號?0517-6611（2019）16-0205-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.16.058

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Optimization?of?Content?Determination?of?Total?Triterpenoids?in?the?Cyclocarya?paliurus?（Batal.）?Iljinskaja?of?Guizhou?and?Its?Origin?Processing?Research

WANG?Wei1，YE?Shi?yun1，YIN?Shao?wen2?et?al?（1.Guizhou?University?of?Traditional?Chinese?Medicine，Guiyang，Guizhou?550000;?2.Guiyang?Third?People′s?Hospital，Guiyang，Guizhou?550000）

Abstract?[Objective]The?research?aimed?to?determine?the?change?of?total?triterpenoid?content?in?different?processing?temperatures?and?different?growth?period?of?Cyclocarya?paliurus，?and?to?determine?the?difference?in?the?optimum?temperature?and?growth?period?of?the?origin?processing?of?Cyclocarya?paliurus.[Method]By?orthogonal?experiment，the?sample?was?extracted?with?70%?ethanol?of?30?times，ultrasonic?extraction?of??40?min，?and?then?the?absorbance?was?determined?at?the?wavelength?of?546.5?nm.The?oleanolic?acid?was?used?as?a?standard?to?determine?the?total?triterpenoid?content.[Result]The?content?of?the?oleanolic?acid?showed?a?better?linear?relationship?with?the?absorbance?in?the?range?of??0.004?1-0.024?6?mg/mL（r=0.999?7）.The?average?recovery?was?99.55%，RSD?was?2.24%（n=6）.The?method?was?reliable.Different?drying?temperature?and?growth?period?of?triterpenoid?content?in?Cyclocarya?paliurus?had?significant?difference，when?the?influence?of?drying?temperature?was?80?℃，the?content?of?total?triterpenes?was?higher?than?other?processing?temperature，the?colour?and?lustre?of?Cyclocarya?paliurus?deepen?at?high?and?low?temperature?conditions，the?impact?to?the?finished?product?appearance.[Conclusion]The?best?drying?temperature?of?Cyclocarya?paliurus?was?80?℃.Because?the?difference?of?total?triterpenoid?content?in?different?growth?years?is?irregular，it?needs?further?research?and?determination.

Key?words?Cyclocarya?paliurus?（Batal.）?Iljinskaja;Drying?temperature;Growing?years;Total?triterpenoids;UV-spectrophotometry;Origin?processing

青錢柳（Cyclocarya?paliurus（Batal）?Iljinskaja）是我國特有的單種屬高大速生喬木，系胡桃科青錢柳屬，在我國各地廣泛分布，在貴州省黔東南苗族自治州有大量的野生資源[1-2]，這為當地的青錢柳種質的研究和種植提供了豐富的資源。在政府的大力支持下，已建立了33.3?hm2的種苗培育基地。青錢柳具有顯著地降低血糖[3-7]、調節血脂[8-9]、降血壓[10-12]的作用而備受醫生學者關注。

近些年，有大量的文獻報道青錢柳具有抗氧化[13-14]、抗腫瘤、提高免疫力[15]的生物活性，青錢柳中的三萜類化合物具有抗菌[16]、減輕β胰島細胞的損傷和抑制凋亡[17]、調節酪氨酸蛋白的磷酸化平衡[18]，促進小鼠胚胎成纖維脂肪細胞對葡萄糖的消耗等作用[19]，三萜類化合物是青錢柳的有效物質基礎之一，包括熊果酸、齊墩果酸、山楂酸、科羅素酸和白樺脂酸等。熊果酸和齊墩果酸對三酰甘油和膽固醇的吸收、合成和代謝都有調控作用，通過過氧化物酶體增殖物促進受體的激活、（PPAR）-α表達和擬胰島素樣作用以及調控脂肪細胞PPAR-γ表達和分化，以控制脂質合成、代謝和轉運的各種關鍵酶基因的表達，從而對抗白色脂肪形成和脂肪細胞激素的炎癥反應，促進棕色脂肪骨骼肌和棕色脂肪生長、增加機體能量消耗。熊果酸、齊墩果酸能穩定葡萄糖、脂質和能量在體內平衡，其是選擇性G蛋白偶聯膽汁酸受體TGR5激動劑[20]。山楂酸可顯著抑制肺癌細胞的增殖及遷移，并抑制由肺癌細胞誘導的破骨細胞分化，這種抑制作用可能是抑制NF-κb通路和激活線粒體凋亡通路所實現[21-22]。科羅索酸對CaSki宮頸癌上皮細胞的抑制增殖和促凋亡的作用是調節PI3K/Akt信號通路得以實現。白樺脂酸在一定的濃度范圍內能夠增強自然殺傷細胞（NK細胞）對SW1990胰腺癌細胞有殺傷作用，其可能通過促進NK細胞增殖，抑制胰腺癌細胞的增殖，能激活NK調節蛋白激酶ERK信號通路，提高NK細胞顆粒酶B、穿孔素、γ-干擾素和CD107a的表達[23]。

筆者以青錢柳中總三萜化合物的含量為指標，通過正交試驗設計法來優化總三萜含量的測定方法及確定不同生長年限和干燥溫度對黔產青錢柳品質的影響[24]，為當地青錢柳的產地加工以及青錢柳類茶劑、酒劑產品的等級劃分提供依據和理論支撐，也為以青錢柳為原料的保健食品、特醫食品的開發奠定基礎。

1?材料與方法

1.1?試驗材料

1.1.1?試劑。

齊墩果酸對照品（上海金穗生物科技有限公司，批號20160511）;無水乙醇（國藥集團化學試劑有限公司，批號60160401）;高氯酸（川東化工，批號20130603）;冰醋酸（柳州市登榜貿易有限公司，批號20151011）;乙酸乙酯（國藥集團化學試劑有限公司，批號20150305）;石油醚（國藥集團化學試劑有限公司，批號20160718）;香草醛（上海譜振生物有限公司，批號20150305）。

1.1.2?樣品。青錢柳采收于貴州省雷山縣，經貴州中醫藥大學葉世蕓教授鑒定為青錢柳（Cyclocarya?paliurus）。將葉片去除雜質，分別采用25（室溫陰干）、60、70、80、90、100?℃恒溫干燥箱干燥，粉碎，密封保存備用。

1.1.3?儀器與設備。

紫外光譜儀（日本島津，型號UV2501PC）;電子天平（瑞士梅特勒公司，型號XS205）;分析天平（上海梅特勒，型號AB204-S）;數顯恒溫水浴鍋（金壇市晶玻實驗儀器廠，型號HH-4）;電熱鼓風干燥箱（天津天泰儀器有限公司，型號101-1A）;超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，型號KQ-100E）。

1.2?試驗方法

1.2.1?齊墩果酸對照品溶液的配制。

取齊墩果酸對照品適量，精密稱定，置于100?mL容量瓶中，用乙酸乙酯溶液進行定容，搖勻，濃度為0.205?0?mg/mL，備用。

1.2.2?供試品溶液的制備方法。

取青錢柳樣品約0.5?g，精密稱定，置于索氏提取器中，加入石油醚，在70?℃水浴中脫脂?3?h，脫脂完成后，將濾渣自然風干后置于圓底燒瓶中，精密加入30?mL的70%乙醇溶液，稱定重量后，置超聲波清洗器中超聲提取40?min后取出，用70%乙醇補足重量，過濾，取續濾液即得青錢柳樣品溶液。

1.2.3?顯色方法。精密量取供試品溶液?0.2?mL，置于10?mL試管中，水浴蒸干，用移液管吸取5%香草醛-冰醋酸溶液?0.2?mL?和高氯酸溶液0.8?mL加入試管中，搖勻，在60?℃水浴中加熱15?min，取出，迅速冷卻后加入4?mL冰醋酸，并用70%的乙醇定容至10?mL，搖勻，即得。

2?結果與分析

2.1?檢測波長

精密量取一定量的齊墩果酸對照品溶液及

供試品溶液，按“1.2.3”方法顯色，用紫外光譜儀在200～?800?nm?波長掃描[25]，確定最大吸收波長為546.5?nm（圖1）。

2.2?標準曲線的繪制

精密吸取齊墩果酸對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2?mL，置于試管中水浴揮干，同時進行顯色處理，在546.5?nm處測定其吸光度。結果發現，齊墩果酸對照品溶液的濃度在0.004?1～0.024?6?mg/mL與吸光度呈良好的線性關系，回歸方程為y=52.864x-0.092?3（r=0.999?7）。

2.3?樣品處理條件的優化

取脫脂后的青錢柳粉適量，精密稱定，將濾渣自然風干后置于圓底燒瓶中，按通過單因素考察的水平，以表1的條件處理樣品，結果見表2。

經方差分析，發現乙醇濃度對含量測定結果有顯著影響（F=5.148，P=0.043<0.05），通過極差和因素指標分析，確定最佳的料液比和超聲時間并經驗證，最終得出最佳的提取條件為：料液比為1∶30，70%乙醇溶液，超聲提取40?min。

2.4?穩定性試驗

精密稱取樣品適量，按“1.2.2”方法處理樣品，按“1.2.3”方法進行顯色，分別于0、5、10、15、20、25?min連續測定6次，結果發現吸光度的RSD為0.30%（n=6），表明樣品在25?min內穩定。

2.5?精密度試驗

精密量取“1.2.1”項下對照品適量，按?“1.2.3”方法顯色，測定吸光度，結果發現吸光度的RSD為?0.27%，表明儀器的精密度良好。

2.6?重復性試驗

取6份青錢柳，精密稱定，分別按“1.2.2”方法處理樣品，按“1.2.3”方法進行顯色，測定吸光度，結果見表3，吸光度的RSD為2.47%，表明該試驗方法重現性良好。

2.7?加樣回收試驗

取已知總三萜含量的藥材6份，精密稱定，加入與已知藥材中總三萜相當量的齊墩果酸，再按?“1.2.2”方法處理，按“1.2.3”方法進行顯色，測定吸光度，結果發現（表4），平均回收率為99.55%，RSD為2.24%，表明該試驗方法可靠。

2.8?樣品的測定?將不同生長年限、不同干燥溫度下的60份青錢柳，按“1.2.2”方法處理，按“1.2.3”方法進行顯色，測定吸光度并計算總三萜含量，結果發現（表5），不同干燥溫

度和生長年限對黔產青錢柳中總三萜含量的影響具有顯著性差異，干燥溫度在80℃時，總三萜的含量高于其他炮制溫度下的。

通過方差分析，干燥溫度F=8.875、P=0.00<0.05，生長年限F=12.841、P=0.000<0.05，所以干燥溫度和生長年限對青錢柳中總三萜的含量有顯著影響。?對60份樣品進行統計分析，低溫和高溫會使青錢柳中的總三萜含量變低，而最佳的干燥溫度為80?℃，結果見圖2。分別對干燥溫度和生長年限總三萜含量的均值進行聚類分析，陰干和100?℃，60、70和90?℃，80?℃聚為3類，而生長年限對總三萜含量的影響無規律可尋，結果見圖3。但從加工過程可以觀察到，樣品的生長年限越長，葉片硬度越大，會造成葉片碎裂，難以成型，最佳的是3～7年生的青錢柳。

3?結論與討論

該研究測定黔產青錢柳在不同炮制溫度及不同生長年限下總三萜含量的變化，以確定青錢柳產地加工的最佳溫度和生長年限對其品質影響的差異。通過正交試驗，確定樣品用30倍量的70%乙醇，超聲提取40min，顯色后，在546.5?nm的波長下測定其吸光度。以齊墩果酸為標準品，測定60批青錢柳樣品總三萜的含量，結果發現，不同干燥溫度和生長年限對黔產青錢柳中總三萜含量的影響具有顯著差異，干燥溫度在80℃時，總三萜的含量高于其他炮制溫度下的，并且高溫和低溫條件下，青錢柳的色澤加深，影響到成品的外觀性狀。青錢柳的最佳干燥溫度為80℃，由于不同生長年限中總三萜含量的差異無規律可尋，有待進一步研究確定。

黔產青錢柳野生資源豐富，歷史悠久，民間多以青錢柳茶飲，以初春嫩葉為原料，經過炒制而成[26]。茶飲氣清香、味甘甜、色澤呈紅棕色，具有生津止渴、清熱解暑的功效，特別適宜于現代三高類慢性疾病人群的飲用[27-28]。隨著貴州省青錢柳種植面積的擴大，青錢柳的采摘和產地加工亟待解決，吳琳琳等[29]采用中藥指紋圖譜的方法，對青錢柳的10個采收期進行研究，確定的最佳采收期在8月末和9月初。通過對當地青錢柳種植基地的調研，當地農民僅憑借經驗，青錢柳在清明節前后采摘，原因是這個季節采摘的葉片破碎率低、干燥率高、容易加工。用傳統炒茶機加工青錢柳，對原料的含水量和硬度要求較高，經過篩選后加工會造成青錢柳資源的浪費，而且加工溫度不易控制，會影響產品質量。該研究以總三萜的含量為指標，對不同生長年限的青錢柳在不同干燥溫度下加工，并考察其對成品性狀的影響，以解決青錢柳的產地加工問題。

貴州省建立了青錢柳種植基地，隨著青錢柳面積種植的擴大化，青錢柳的規范化種植、產地加工等技術亟待解決。青錢柳的產地炮制溫度就是其影響品質的關鍵技術之一，該研究結果可以作為青錢柳產地加工的技術支撐，也為以后加工設備參數的設定提供理論依據。青錢柳于冰川世紀保存至今，是國家重點保護的瀕危植物之一[30]?，但在對貴州省青錢柳種植基地進行資源考察時發現，由于加工設備的落后，導致生長年限較久的葉子無法加工，造成大量的稀缺資源的浪費。該研究也對不同生長年限的青錢柳的質量進行了初步探討，結果無規律可尋，所以有待進一步研究。

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