冷榨花生粉中蛋白質的超聲波輔助提取試驗研究

夏瀟瀟　湛琴琴　姜明敏　王飛

摘要?以冷榨花生粉為原料，使用超聲波輔助Tris-HCl溶液提取冷榨花生粉中的蛋白質，考察液料比、超聲時間、超聲頻率和提取溫度對花生蛋白提取率的影響。單因素試驗和正交試驗結果表明，當液料比為50∶1、超聲時間為20?min、超聲頻率為70?kHz、提取溫度為?40?℃時，冷榨花生粉中蛋白質的提取率可達87.22%。

關鍵詞?冷榨花生粉;超聲波;蛋白;提取率

中圖分類號?TS21文獻標識碼?A

文章編號?0517-6611（2019）16-0220-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.16.062

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Ultrasound?assisted?Extraction?Experiment?of?Protein?from?Cold?pressed?Peanut?Powder

XIA?Xiao?xiao，ZHAN?Qin?qin，JIANG?Ming?min?et?al?（Department?of?Biology?&?Environmental?Engineering，Hefei?University，Hefei，Anhui?230601）

Abstract?Cold?pressed?peanut?powder?was?used?as?raw?material?to?extract?protein?with?Tris?HCl?solution?assisted?by?ultrasound.The?effects?of?liquid?to?material?ratio，ultrasonic?time，ultrasonic?frequency?and?temperature?on?the?extraction?rate?of?peanut?protein?were?investigated.?The?results?of?single?factor?experiment?and?orthogonal?experiment?showed?that?the?extraction?rate?of?protein?in?cold?pressed?peanut?powder?could?reach?87.22%?when?the?liquid?to?material?ratio?was?50∶1，the?ultrasonic?time?was?20?min，the?ultrasonic?frequency?was?70?kHz?and?the?extraction?temperature?was?40?℃.

Key?words?Cold?pressed?peanut?powder;?Ultrasonic?wave;?Protein;?Extraction?rate

花生被譽為“長生果”“植物肉”“綠色牛乳”[1]，是一種重要的油料作物，也是植物蛋白質的重要來源之一?；ㄉ鞍谞I養(yǎng)價值高，含有人體必需的氨基酸，不含膽固醇，且消化系數(shù)在90%以上[1-2]。

傳統(tǒng)的蛋白質提取方法存在耗時長、效率低、操作繁瑣等缺點[3-4]。超聲波是一種機械能量形式[5]，能在液態(tài)體系中產(chǎn)生空化效應。強烈的空化效應會讓空化泡在崩潰的同時瞬間釋放局部高溫和高壓，因而會產(chǎn)生劇烈沖擊、剪切等作用力。當空化效應發(fā)生在植物組織周圍時，可以引發(fā)細胞破碎，促進目標物質的釋放和溶出[5-7]。因此，超聲波是一種有效的輔助萃取手段，已被廣泛應用于天然產(chǎn)物、生物活性物質、功能改性等領域，是一種安全、綠色、環(huán)境友好的提取方法[8-14]。筆者采用超聲波輔助Tris-HCl溶液提取冷榨花生粉中的蛋白質，對影響其提取率的因素（液料比、超聲時間、超聲頻率和提取溫度）進行了優(yōu)化，旨在為其工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?材料與試劑?花生，購于安徽省合肥市濱湖永輝超市;考馬斯亮藍G-250，購自國藥集團化學試劑有限公司;三羥甲基氨基甲烷，購自上海陽光生物科技有限公司;氫氧化鈉，購自西隴化工股份有限公司;鹽酸，購自江蘇強盛功能化學股份有限公司;硫酸，購自西隴化工股份有限公司，試驗試劑均為分析純。標準蛋白，購自北京索萊寶科技有限公司，優(yōu)級純GR。蒸餾水，自制。

1.2?儀器與設備

MI-S1榨油機，為中山麥爾尼電器有限公司產(chǎn)品;DHG-9140A電熱恒溫鼓風干燥箱，為上海光都儀器設備有限公司產(chǎn)品;Centrifuge5810高速臺式離心機，為德國Eppendorf?AG公司產(chǎn)品;722可見分光光度計，為上海佑科儀器儀表設備有限公司產(chǎn)品;JK-DYJ500金尼克超聲波清洗器，為合肥金尼克機械制造有限公司產(chǎn)品;pHS-25?pH計，為上海儀電科學儀器產(chǎn)品。

1.3?試驗方法

1.3.1?花生總蛋白的測定?；ㄉ械牡鞍踪|總量采用凱氏定氮法測定。①稱取0.2?g樣品粉末，精確至0.001?g，移入干燥的25?mL定氮瓶中，加入0.2?g硫酸銅、6?g硫酸鉀，再加入20?mL濃硫酸，輕搖后于瓶口放一小漏斗，將瓶以45°角斜支于有小孔的石棉網(wǎng)上，在溫度約100?℃條件下小心預熱2?h，待內(nèi)容物全部炭化，泡沫完全停止后，將溫度升至350?℃，并保持瓶內(nèi)溶液微沸狀態(tài)，待溶液由黑色變?yōu)樽攸S色，再變?yōu)樗{綠色并澄清后，再繼續(xù)加熱1?h。取下冷卻，小心加入?20?mL純凈水。放冷后，移入100?mL容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混勻備用。②將裝有消化溶液的定氮瓶放入定氮儀，接通冷凝水開啟儀器經(jīng)過加堿、硼酸、加熱、酸化、滴定，最終得到樣品中的蛋白質含量。有機物中的銨根在強熱條件下與CuSO?4、濃H?2SO?4作用，硝化生成（NH?4）?2SO?4。③用已知濃度的H?2SO?4標準溶液滴定，根據(jù)HCl消耗的量計算出氮的含量，然后乘以相應的換算因子，即得蛋白質的含量。蛋白質含量的計算公式：

蛋白質含量=?N×6.25

式中，N為含氮量，N（%）=[1.401×M×（V-V?0）]/W;M為標準酸的摩爾濃度（mol/mL）;W為樣品的重量（g）;V?0為空白樣滴定標準酸的消耗量（mL）;V為樣品滴定標準酸的消耗量（mL）。

1.3.2?花生中蛋白質的提取步驟?；ㄉ械鞍踪|的提取步驟如下：新鮮花生→冷榨去油→粉碎→取適量稱重→加入Tris-HCl溶液進行超聲波輔助萃取→離心→取上清液→測定蛋白質的提取質量。

1.3.3?Lowry試劑盒法測定蛋白質含量。取5?μL樣品置于?5?mL離心管中，然后加入250?μL?RC?Reagent?Ⅰ，并振蕩，室溫下靜置1?min，然后加入250?μL?RC?Reagent?Ⅱ，振蕩，然后進行15?000?r/min離心7?min，去上清，留沉淀，取干凈50?mL大離心管，加入100?μL?DC?Reagent?S和5?mL?DC?Reagent?A混勻，然后取255?μL混合液加入離心后沉淀物中，振蕩搖勻，靜置?15?min，最后用分光光度計于波長750?nm下測定溶液吸光度。

1.3.4?蛋白質提取率的計算。按以下公式計算蛋白質提?取率：

蛋白質提取率=超聲波輔助提取蛋白質量（g）冷榨花生粉中蛋白質含量（g）×100%

2?結果與分析

2.1?冷榨花生粉中蛋白質總量

使用凱式定氮儀測得冷榨花生粉中總蛋白質含量為48.3%。

2.2?單因素試驗結果

2.2.1?液料比對蛋白質提取率的影響。

當提取時間為?15?min，超聲頻率為60?kHz，提取溫度為40?℃時，考察不同液料比，即20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1?（mL∶g）對蛋白質提取率的影響，結果如圖1所示。

由圖1可知，冷榨花生粉中蛋白質的提取率隨著液料比的提高而升高，當液料比達到50∶1后，隨著液料比的持續(xù)加大，蛋白質提取率的上升速度變緩。這是因為萃取溶劑適度增加有利于蛋白質與溶劑的接觸，增大擴散作用。當目標蛋白質量確定時，大部分蛋白質已被萃取，此時再增加萃取液用量，提取率緩慢增長，溶液中蛋白質濃度下降，造成萃取劑?浪費。

2.2.2?超聲時間對蛋白質提取率的影響。

當液料比為50∶1，超聲頻率為60?kHz，提取溫度為40?℃時，考察不同超聲時間（5、10、15、20、25?min）對蛋白質提取率的影響，結果如圖2?所示。

從圖2可以看出，隨著超聲時間的增加，冷榨花生粉中蛋白質的提取率先增加后減小，在超聲輔助萃取時間為?20?min?時達到最大。這是因為超聲波能引起特殊的空化效應，空化效應瞬間形成的高溫高壓可以破壞植物細胞組織，從而促使有效成分大量釋放[15]。但若超聲時間過長，超聲會引起局部過熱，從而破壞蛋白質的組織結構，使其提取率降低。

2.2.3?超聲頻率對蛋白質提取率的影響。

當液料比為?50∶1，提取時間為15?min，提取溫度為40?℃時，考察不同超聲頻率（40、50、60、70、80?kHz）對蛋白質提取率的影響，結果如圖3所示。

超聲頻率越小，瞬態(tài)空化效應越顯著，形成的瞬間沖擊波和射流能破碎植物細胞，促進蛋白質溶出，提高提取效率，但瞬態(tài)空化效應過強也會破壞被提取蛋白質的結構，引發(fā)蛋白質變性沉淀;超聲頻率越大，萃取液的稀薄相會減小，空化效應向穩(wěn)態(tài)空化轉變，空化效應減弱，萃取液在花生粉周圍形成微流，而植物細胞被破壞程度小，目標物質的提取率低。由圖3可以看出，隨著超聲頻率的增加，冷榨花生粉中蛋白質的提取率先增加后減小，當超聲頻率為60?kHz時，蛋白質的提取率達到最大值。

2.2.4?提取溫度對蛋白質提取率的影響。

當提取液pH為?8.0，提取時間為15?min，液料比為50∶1，超聲頻率為60?kHz時，考察不同提取溫度（20、30、40、50、60?℃）對蛋白質提取率的影響，結果如圖4所示。

由圖4可知，冷榨花生粉中蛋白質的提取率隨著提取溫度的升高呈先增大后減小的趨勢。當提取溫度過高時，會引起蛋白質的分子結構發(fā)生變化，蛋白質發(fā)生沉淀，Tris-HCl溶液的蛋白質提取率下降。

2.3?正交試驗?在單因素試驗結果的基礎上，設計正交試驗，確定最佳固定化條件，每組試驗重復3次。正交試驗的因素與水平設計見表1，正交試驗結果見表2。

從表2可以看出，優(yōu)化方案為A?2B?3C?2D?2，影響冷榨花生粉中蛋白質提取率的因素從低到高依次為超聲時間、超聲頻率、提取溫度、液料比。因此，冷榨花生粉中蛋白質提取的最優(yōu)方案：液料比50∶1（mL/g）、超聲時間20?min、超聲波頻率70?kHz、提取溫度為40?℃。

2.4?驗證試驗

根據(jù)正交試驗得到的最佳固定化條件進行3次平行驗證性試驗，結果發(fā)現(xiàn)在液料比50∶1、超聲時間?20?min、超聲頻率70?kHz、提取溫度40?℃的條件下，冷榨花生粉中蛋白質的提取率為87.22%。

3?討論

超聲波的空化效應可以破壞植物細胞結構，能有效促進目標物質溶解于萃取溶劑，但由于蛋白質的空間結構易被破壞，因此在實際操作中需要考慮超聲頻率、時間、溫度等因素對蛋白質結構的影響[16-18]。該研究對影響超聲波輔助提取冷榨花生粉中的蛋白質的4個因素（液料比、超聲時間、超聲頻率和提取溫度）進行優(yōu)化，最終確定超聲波輔助萃取冷榨花生粉中的蛋白質的最優(yōu)條件如下：液料比50∶1、超聲時間?20?min、超聲頻率70?kHz、提取溫度40?℃，在此條件下蛋白質的提取率可達87.22%。

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