孕前外周血淋巴細胞亞群與IVIG治療反復妊娠失敗患者妊娠結局的相關性①

李陽陽 朱 丹 阮加里 鮑時華

(同濟大學附屬第一婦嬰保健院生殖免疫科，上海201204)

復發性流產 (Recurrent spontaneous abortion,RSA) 是指連續發生2次或2次以上的自然流產[1]。反復移植失敗(Repeated implantation failure，RIF)目前被定義為移植至少3次新鮮或冷凍周期(至少4個優質胚胎)著床失敗,或移植優質胚胎3次或胚胎數目大于10個以上失敗[2]。臨床上習慣將RSA和RIF合并稱為反復妊娠失敗(Recurrent reproductive failure，RPF)。尚沒有針對RPF的規范化診療指南或專家共識，一般認為適用于RSA的病因篩查和治療策略同樣也適用于RPF。1994年人們首次嘗試用靜脈注射免疫球蛋白(Intravenous immunoglobulin，IVIG)治療RSA患者[3]，隨后研究者們在臨床上不斷進行深入研究，繼而IVIG逐漸被用于治療免疫異常的RPF患者，然而不同研究觀察到的治療效果卻不相同。

越來越多的證據表明RPF的發生與母體免疫系統的紊亂存在密切聯系[4]，而淋巴細胞是機體免疫系統的重要組成部分。其中，T細胞(CD3+T cell)主要參與細胞免疫應答；B細胞(CD19+B cell)則與體液免疫息息相關。為了探討淋巴細胞亞群水平與IVIG治療RPF患者妊娠結局的相關性，本文采用回顧性隊列研究設計，收集患者臨床基本資料、外周血淋巴細胞亞群水平、IVIG治療方案以及妊娠結局，分析臨床基本資料和淋巴細胞亞群與IVIG治療預后的關系，為臨床診治提供參考。

1 資料與方法

1.1臨床資料 采用回顧性隊列研究方法，納入2014年1月至2016年12月上海市第一婦嬰保健院生殖免疫科接受IVIG治療的RPF患者1 046例，隨訪截止日期為2017年12月。納入標準：①25～49周歲女性；②病史完整；③RSA次數≥2次和/或RIF≥3次的患者；④接受IVIG治療；⑤相關生殖免疫檢查結果完整。排除標準：①3個月內有嚴重過敏史、外傷史、手術史者；②有精神疾病史或精神疾病家族史者；③研究期間發生2次及2次以上受孕者；④未孕、宮外孕和生化妊娠者；⑤近期使用免疫抑制劑的患者。本研究經上海市第一婦幼保健院倫理委員會審核批準，患者均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1治療方案 本研究為描述性回顧分析，無實驗性地干預臨床治療。針對患者不同的病因，均采取針對性處理，比如子宮解剖異常患者，行宮腔鏡治療等。目前IVIG治療國際上并無統一治療方案，本科室將IVIG作為二線治療，均在常規阿司匹林和/或低分子肝素治療失敗后，再次備孕或受孕時使用IVIG治療。具體來說，孕前方案為RSA患者在排卵期開始使用，RIF患者在移植前1周使用，均相當于著床前7 d左右。孕后方案在確認妊娠后即開始使用。一般按每千克體重250～300 mg計算IVIG使用劑量，2周1次，使用2～3次。

1.2.2資料收集 所有患者均按復發性流產診治的專家共識開展全面的病因篩查[5]，主要分為以下8類病因，流行病學因素(包括既往流產史、孕婦年齡等)、解剖結構因素(如宮腔黏連、弓形子宮、單角子宮等)、血栓前狀態(包括蛋白S缺乏、蛋白C缺乏、抗凝血酶原Ⅲ缺乏等)、遺傳因素(包括夫婦染色體異常和胚胎染色體異常)、內分泌因素[如胰島素抵抗(IR)、甲減、高雄激素血癥、糖尿病、高泌乳素血癥等]、感染因素、免疫因素[包括自身免疫型RSA，如抗磷脂綜合征(Antiphospholipid syndrome，APS)、不典型APS(即有相關抗體陽性，但尚未達到診斷標準)、橋本氏甲狀腺炎(Hashimotos thyroiditis，HT)、未分化結締組織病(Undifferentiated connective tissue disease，UCTD，指的是具有結締組織病的特征、但又不符合特定疾病的診斷[6])和同種免疫型RSA(如自然殺傷細胞數量及活性升高、Th1/Th2細胞因子異常等)]，以及不良環境和生活習慣。最后，我們將經上述包括免疫和凝血等病因篩查后，仍未發現病因的歸入不明原因RPF(Unexpressed RPF,URPF)。

1.2.3淋巴細胞亞群檢測 檢測試劑由BD Science公司提供(BD Multitest CD3 FITC/CD8 PE/CD45PerCP/CD4 APC and CD3 FITC/CD16 PE+CD56 PE/CD45 PerCP/CD19 APC)，采用流式細胞儀(BD FacsCaliburTMFlow Cytometer,USA)對外周血CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD16+CD56+、CD19+淋巴細胞亞群水平進行檢測，操作按說明書進行。結果用各細胞亞群占總淋巴細胞百分比來表示，由Multitest分析軟件自動完成。

2 結果

2.1患者資料 經篩選，符合本研究且完成隨訪，可以進入統計分析的受試者共有1 046例，包括RSA患者850例(占總數81.26%)、RIF患者196例(占總數18.74%)。臨床基線資料如表1所示，按妊娠結局分成活產組和流產組。RPF總體活產率為58.99% (617/1 046)，其中RSA的活產率為62%(527/850)、RIF的活產率為45.92%(90/196)，RSA組的活產率顯著高于RIF組。按不同病因來看，不明原因和自身免疫因素中活產率相對較高，分別為63.64%和57.21%，細胞免疫異常中活產率為53.98%(圖1)。

流產組患者年齡高于活產組(P<0.001)；流產組患者BMI高于活產組(P=0.01)；流產組患者曾經流產次數高于活產組(P<0.001)。此外，是否存在解剖結構異常、是否有細胞免疫異常活產率不同、曾經移植失敗次數、內分泌因素、自身免疫因素、血栓前狀態及不明原因因素均與活產率無關。

表1 1046例反復妊娠失敗患者臨床基本特征與妊娠結局之間的關系

Tab.1 Relationship between clinical basic characteristics and pregnancy outcomes

VariableLive birth(n=617)Miscarriage(n=429)P-valueDiagnosis<0.001RSA527(85.41%)323(75.29%)RIF90(14.59%)106(24.71%)Age(year)32.62±4.5435.16±5.73<0.001BMI(kg/m2)21.70±3.4322.15±2.610.01The number of RSA3.22±1.463.66±1.71<0.001The number of RIF4.42±1.954.92±2.410.07Chromosome abnormal1)Absent610(98.87%)417(97.20%)Present7(1.13%)12(2.80%)Endocrine Absent428(69.37%)278(64.85%)0.13Present189(30.63%)151(35.15%)AnatomyAbsent568(93.73%)370(87.89%)0.001Present38(6.27%)51(12.11%)AutoimmuneAbsent375(60.78%)248(57.81%)0.33Present242(39.22%)181(42.19%)Cellular immunity2)Absent389(63.04%)234(54.55%)0.007Present228(36.96%)195(45.45%)Infections1)Absent614(99.51%)428(99.77%)Present3(0.49%)1(0.23%)HemagglutinationAbsent500(81.04%)331(77.16%)0.14Present117(18.96%)98(22.84%)URPFAbsent525(85.09%)376(87.65%)0.22Present92(14.91%)53(12.35%)Time of IVIG started Before pregnancy495(80.17%)280(65.22%)0.17During pregnancy122(19.83%)149(34.78%)

Note：1)Further statistical analysis was not performed because the number of patients with chromosomal abnormalities or infection is less than 10;2)The diagnostic criteria for abnormal cellular immunity are based on the reference range of peripheral blood lymphocyte subsets in the normal women of childbearing age established in our laboratory:CD3+:63.04-77.98;CD3+CD4+:25.80-38.74；CD3+CD8+:21.30-34.38；CD16+CD56+:9.50-23.70；CD19+:8.08-15.20.

2.2淋巴細胞亞群水平在不同妊娠結局之間的比較 圖2示患者淋巴細胞亞群水平在不同妊娠結局之間的比較。流產組孕前CD3+細胞為69.71±8.73(%)、活產組為67.16±9.46(%)，流產組CD3+細胞水平顯著高于活產組(P=0.02)；流產組孕前CD19+細胞為12.18±4.14(%)、活產組為13.86±4.63(%)，流產組CD19+細胞水平顯著低于活產組(P=0.03)；孕前CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD16+CD56+在兩組之間均無顯著性差異。

2.3單因素分析 單因素分析結果顯示(表2)，年齡是RPF患者IVIG治療預后的危險因素，年齡每增加1歲，流產風險增加10% (P<0.001)；曾經流產次數每增加1次，流產風險增加19% (P=0.002)。 與RSA相比， RIF患者流產風險增加92%(P<0.001)；在各類病因中，解剖結構異常和細胞免疫異常是RPF患者IVIG治療預后的危險因素。從淋巴細胞亞群水平看，孕前CD3+和CD19+細胞與妊娠結局有關，孕前CD3+細胞每增加1%，患者流產的風險增加2%(P=0.02)；孕前CD19+細胞每增加1%，患者流產風險下降3%(P=0.03)。

圖1 不同病因反復妊娠失敗患者IVIG治療活產率Fig.1 Live birth rate of patients with recurrent reproductive failure after IVIG treatmentNote: Couples with chromosomal abnormalities or infection factors in the group of patients less than 10 were not analyzed

圖2 淋巴細胞亞群水平在不同妊娠結局之間的比較Fig.2 Comparison of lymphocyte subsets between different pregnancy outcomesNote: *.P=0.02；**.P=0.03.

表2 淋巴細胞亞群水平、臨床基本特征與妊娠結局關系的單因素分析

Tab.2 Univariate analysis of relationship between lympho-cyte subsets or clinical basic characteristics and pregnancy outcomes

VariableORP-valueAge(year)1.10(1.07,1.13)<0.000 11)BMI(kg/m2)1.05(0.98,1.12)0.18Number of RSA1.19(1.09,1.31)0.000 21)Number of RIF1.11(0.99,1.24)0.07Diagnosis RSA1.0 RIF1.92(1.40,2.63)<0.000 11)Chromosome abnormal Absent1.0 Present2.30(0.88,5.97)0.09Endocrine Absent1.0 Present1.22(0.94,1.59)0.13Anatomy Absent1.0 Present2.06(1.33,3.20)0.0011)Autoimmune Absent1.0 Present1.13(0.88,1.46)0.34Cellular immunity Absent1.0 Present1.42(1.10,1.82)0.0071)Infections Absent1.0 Present0.48(0.05,4.62)0.53Prethrombotic state Absent1.0 Present1.26(0.93,1.71)0.14URPF Absent1.0 Present0.80(0.55,1.15)0.22Time of IVIG started Before pregnancy1.0 During pregnancy1.05(0.51,2.19)0.89CD3+ cells(%)1.02(1.00,1.03)0.02CD3+CD4+ cells(%)1.02(1.00,1.03)0.08CD3+CD8+ cells(%)1.00(0.98,1.02)0.66CD16+CD56+ cells(%)0.99(0.98,1.01)0.37CD19+ cells(%)0.97(0.93,1.00)0.03

表3 CD3+及CD19+細胞百分數與妊娠結局關系多元回歸方程分析

Tab.3 Multiple regression equation analysis of relations-hip between CD3+or CD19+cell percentage and pregnancy outcome

VariableNon-adjusted1)OR(95%CI) PAdjust2)OR(95%CI) PCD3+1.03(1.00,1.17) 0.021.04(1.01,1.29) 0.01CD19+0.95(0.93,0.99) 0.030.95(0.90,0.98) 0.04

Note：1)Non-adjusted model adjust for:None;2)Adjust model adjust for:age,BMI,the number of RSA,the number of RIF,diagnois,chromosome abnormal,endocrine,anatomy,autoimmune,infections,hemagglutination,URPF and time of IVIG started.

2.4多元回歸分析 單因素分析結果提示：年齡、臨床診斷(RSA或RIF)、曾經流產次數、是否存在解剖異常、是否存在免疫異常都是影響妊娠結局的因素，為了評價外周血淋巴細胞亞群水平與妊娠結局之間的獨立作用大小，我們應用多元回歸方程，將上述可能的影響因素作為調整變量。表3示，在調整了年齡、BMI、流產或移植失敗次數、不同病因以及IVIG用藥開始時間后，孕前CD3+細胞水平仍然是RPF患者IVIG治療妊娠結局的獨立危險因素，方程顯示：CD3+細胞水平每增加1%，患者流產風險增加4%(P=0.01)；孕前CD19+細胞仍然是RPF患者IVIG治療妊娠結局的獨立保護因素，CD19+細胞水平每增加1%，患者流產風險下降5%(P=0.04)。

3 討論

復發性流產在育齡期女性中的發生率約為5%，約1%的女性經歷3次或3次以上的流產[1]，嚴重影響了育齡期女性的身體和心理健康。母體免疫系統能夠對半同種異體胚胎不產生排斥，并且能夠保護母體和胎兒免受外界病原菌的侵襲，主要依靠母體免疫系統的激活與耐受達到平衡[7]。近年來，生殖免疫學領域的大量研究表明，免疫功能紊亂是RSA、RIF以及其他妊娠并發癥的病因之一[8-10]。研究發現RPF患者的T細胞比值存在異常,CD4+T細胞中Th1/Th2平衡向Th1偏離[11]。同時B細胞，特別是B-1a B細胞，可以使T細胞激活或耐受，也在妊娠中發揮重要作用[12]。另有多篇文獻報道，與正常育齡期女性相比，RPF患者外周血和子宮內膜中NK細胞比例和毒性增加[13,14]。目前臨床上治療免疫因素導致RPF的藥物主要有阿司匹林、低分子肝素以及靜脈注射免疫球蛋白(Intravenous immunoglobulin，IVIG)等。前兩種藥物的治療效果已經在臨床上獲得了一致認可，而靜脈注射免疫球蛋白仍存在爭議。臨床上常根據外周血Th1/Th2比例，CD56+CD3-細胞比例等來評估是否采用IVIG治療。因此，測定孕前外周血淋巴細胞亞群水平對預測IVIG治療RPF患者的流產風險具有重要意義。

3.1淋巴細胞亞群與妊娠結局的關系 研究表明，T細胞亞群水平與妊娠結局相關，Th1/Th2、 Th17/Treg細胞比例失調會導致RPF的發生[15]。Winger等[16]研究發現，Th1/Th2或CD56+細胞比例升高的患者經IVIG治療后，IVF的妊娠結局明顯改善，而孕前細胞比例正常的患者，是否使用IVIG治療成功率沒有差異，提示孕前外周血Th1/Th2與CD56+比例可以用于預測IVIG的治療效果。近期研究指出[17,18]，IVIG能夠調節Th1/Th2、Th17/Treg平衡、增強Th2、Treg細胞的功能，從而改善RPF患者的妊娠結局。本研究結果顯示，外周血淋巴細胞亞群中總T水平是反復妊娠失敗患者IVIG治療預后的獨立危險因素，在調整了年齡、BMI、流產或移植失敗次數、不同病因以及IVIG用藥開始時間等可能混雜因素后，孕前CD3+細胞水平每增加1%，患者流產風險增加4%。另外結果提示孕前NK細胞水平與妊娠結局無關，考慮我們選擇的患者群體不同所致。

而外周血淋巴細胞亞群中B細胞水平是反復妊娠失敗患者IVIG治療預后的獨立保護因素，在調整了年齡、BMI、流產或移植失敗次數、不同病因以及IVIG用藥開始時間等可能混雜因素后，孕前CD19+細胞水平每增加1%，患者流產風險下降5%。文獻表明，B淋巴細胞一方面能夠分泌IgG類妊娠保護性抗體，另一方面通過分泌免疫調節細胞因子IL-10促進妊娠耐受，從而保護胎兒使妊娠得以繼續維持[19,20]。近期有研究發現，漿細胞同種異體抗原1(Plasma cell alloantigen 1,PC1)(一種Ⅱ型跨膜糖蛋白)的表達水平與B細胞亞群分泌IL-10的能力密切相關，PC1高表達的B細胞比PC1 低表達的B細胞分泌更多的IL-10，能夠維持胎兒存活，而PC1低表達的B細胞則可能損害胎兒的健康[21]。Jablonowska等[22]對妊娠6～8周的RSA患者進行外周血淋巴細胞亞群檢測，接著給予患者IVIG或安慰劑治療，在分娩或流產后再次檢測淋巴細胞水平，結果顯示2次外周血B細胞水平與妊娠結局均無明顯關系。這提示，不同時期，不同亞群的B淋巴細胞水平可能與IVIG治療結局的關系不同。

3.2其他因素 在臨床基線資料中，患者年齡是影響妊娠結局的危險因素，與文獻中年齡與不良妊娠結局相關的結論相一致[23,24]，所不同的是我們提供了效應值，即年齡每增加1歲，發生流產的風險增加10%。關于既往流產次數對妊娠結局的影響，有文獻報道既往無流產史、流產1次和流產2次以上的3組患者間保胎成功率的差異均無統計學意義(P>0.05)[24]。Lee等[25]研究表明，對于2、3、4、5次流產患者，IVIG治療成功率并沒有明顯不同(范圍為84.6%至89.7%)，6次以上的成功率相對較低(62.5%)，但與2、3、4、5次的成功率沒有統計學差異。我們將既往流產次數對妊娠結局的影響進行了量化，發現流產次數每增加1次，再次發生流產的風險增加19%。

綜上所述，孕前CD3+T細胞可能是RPF患者IVIG治療妊娠結局的獨立危險因素，而孕前CD19+B細胞可能是其獨立的保護因素，外周血淋巴細胞亞群檢測對預測IVIG治療妊娠結局有一定的臨床價值。IVIG治療RPF有較好的前景，需進一步探討RPF的發病機制、IVIG治療RPF的作用機制和預后判斷指標，并需要更多高質量且針對IVIG治療RPF的適合人群、人種、用藥劑量和用藥時機的前瞻性隨機對照試驗來證實其有效性。