病毒性腦炎患兒淋巴細胞亞群及腦脊液炎癥因子的檢測分析①

屠友權 方春艷 呂 勤

(寧波市婦女兒童醫院，寧波315012)

病毒性腦炎是兒科常見的中樞神經系統感染性疾病,近年來在兒童中的發病率有增高趨勢,主要表現為發熱、頭痛和抽搐，多數完全恢復，但少數遺留癲癇、癱瘓、智能發育遲緩等后遺癥，其發病機制尚未明確，病毒感染后常在患兒體內沿血行及神經播散,引起炎性反應及腦損傷，并導致機體免疫功能的紊亂，淋巴細胞在該病的發生、發展過程中具有重要作用；細胞因子又引起繼發性腦損傷[1，2]。本研究通過檢測病毒性腦炎患兒淋巴細胞亞群及腦脊液TNF-α、IL-2、IL-6、IL-10水平的變化，探討其在病毒性腦炎患兒發病中的作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 2015年1月～2018年1月寧波市婦女兒童醫院住院的病毒性腦炎患兒128例，年齡3～14歲，平均年齡(8.2±5.4)歲，其中男性68例(53.13%)，女性60例(46.87%)，重癥組66例,輕癥組62例，參照重型輕型病毒性腦炎診斷標準進行分組[3]。另選取同期在我院兒外科擇期手術腰椎間隙麻醉患兒60例作為對照組,男35例,女25例,其中隱睪25例,斜疝病25例,尿道下裂10例，無近期感染及過敏性疾病等病史,無免疫制劑應用，并排除神經系統疾病的患兒,CSF常規、生化檢查無異常。所有研究對象沒有免疫系統疾病、進行性肝病、腎病、惡性腫瘤、糖尿病、敗血癥或其他的感染性疾病。

1.2方法

1.2.1治療方法 輕型組入院后常規給予控制高熱、控制抽搐、脫水降顱壓、抗病毒等處理；重型組在常規治療基礎上給予甲基強的松龍沖擊治療，用藥3 d，減量至1～2 mg/(kg·d)，用藥3～5 d，同時予大劑量IVIG靜脈輸注[1 g/(kg·d)]，用藥2 d，頻繁驚厥者加用丙戊酸鈉治療。

1.2.2T淋巴細胞亞群的檢測 所有檢測者均用EDTA-K2抗凝管空腹抽靜脈血1.8 ml，經相應的熒光標記單克隆抗體染色，避光室溫孵育20 min，用FACSLysing solution溶血處理，流式細胞儀測定CD3+、CD4+、CD8+、CD19+、CD16+CD56+、CD4+/CD8+、CD4+CD25+淋巴細胞亞群水平。

1.2.3腦脊液TNF-α、IL-2、IL-6、IL-10水平檢測 所有檢測者于入院24 h內治療前行腰椎穿刺,收集腦脊液標本，2 000 r/min離心10 min,取上清液置-80℃冰箱待測。采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附法(ELISA)測定TNF-α、IL-2、IL-6、IL-10含量,試劑盒來自美國BD公司，嚴格按照說明書進行操作。

2 結果

2.1各組間淋巴細胞亞群比較 CD3+、CD4+、CD8+、CD19+、CD16+CD56+、CD4+/CD8+、CD4+CD25+細胞水平在各組間比較差異有統計學意義(P<0.05)；CD3+、CD4+、CD4+CD25+、CD4/CD8重型組低于輕型組和對照組(P<0.05)，CD8+、CD19+、CD16+CD56+重型組高于輕型組和對照組(P<0.05)；輕型組與對照組比較，CD3+、CD4+、CD16+CD56+、CD4+CD25+差異有統計學意義(P<0.05)；CD8+、CD19+、CD4+/CD8+差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.2各組間腦脊液TNF-α、IL-2、IL-6、IL-10水平比較 病毒性腦炎患兒腦脊液中TNF-α、IL-2、IL-6、IL-10水平在各組間比較差異有統計學意義(P<0.05),重型組高于輕型組和對照組(P<0.05)，輕型組高于對照組(P<0.05)。見表2。

2.3治療前后淋巴細胞亞群比較 CD3+、CD8+、CD19+、CD4+/CD8+細胞水平在治療前后比較差異有統計學意義(P<0.05)，CD4+、CD16+CD56+、CD4+CD25+治療前后比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

GroupsnCD3+CD4+CD8+CD19+CD16+CD56+CD4+/CD8+CD4+CD25+Light group6259.20±8.301)32.74±6.251)26.99±7.012)21.05±3.952)12.60±1.491)1.30±0.452)5.94±2.171)Severe group6655.24±6.6729.86±4.8030.26±5.1326.52±7.2013.38±1.341.03±0.193.89±1.55Control group6064.23±6.1237.98±6.1825.60±6.2120.26±4.7911.88±1.781.43±0.698.06±2.36F25.0431.589.5224.2715.2711.2264.76P<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05

Note：Compared with the control group,1)P<0.05,2)P>0.05.

GroupsnTNF-αIL-2IL-6IL-10Light group6267.09±31.58378.46±122.9261.84±29.3119.37±9.14Severe group6687.78±33.39601.77±231.5487.61±18.1234.49±10.46Control group6030.23±11.3385.85±57.3429.90±15.716.38±0.77F68.19168.8993.54187.25P<0.05<0.05<0.05<0.05

GroupsnCD3+CD4+CD8+CD19+CD16+CD56+CD4+/CD8+CD4+CD25+Before treatment12857.18±7.7431.28±5.7228.65±6.3223.83±6.4213.01±1.481.16±0.364.91±2.14After treatment12862.55±4.7137.24±5.6725.63±4.3921.37±4.6712.09±1.771.46±0.738.03±1.99t-6.7-8.384.453.454.67-4.11-12.14P<0.05>0.05<0.05<0.05>0.05<0.05>0.05

GroupsnTNF-αIL-2IL-6IL-10Before treatment12877.59±34.01491.86±216.6974.93±27.42193.37±9.14After treatment12832.23±10.4281.86±40.3829.84±11.06 6.76±1.07t14.382118.2818.45P<0.05<0.05<0.05<0.05

2.4治療前后腦脊液TNF-α、IL-2、IL-6、IL-10水平比較 腦脊液TNF-α、IL-2、IL-6、IL-10水平治療前高于治療后，差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

3 討論

病毒性腦炎主要由病毒感染及機體細胞免疫功能降低引起，以腦實質炎癥為主的中樞系統疾病。病原體侵入機體及中樞神經系統后，可刺激激活機體免疫細胞，使之活化產生應答，引起宿主對病毒抗原發生免疫反應，繼而引起神經元及血管內皮細胞損傷，進一步導致血管及其周圍腦組織損害。已有研究表明,病毒性腦炎的發生、發展與機體的免疫功能密切相關，同時大量炎癥因子的產生和釋放又會破壞機體的免疫平衡，產生多種病理損傷[4，5]。

在本研究中，重型組CD3+、CD4+T 淋巴細胞、CD4+/CD8+、CD4+CD25+較輕型組與對照組明顯降低(P<0.05)，CD3+代表T淋巴細胞水平，我們推測其降低表明重型組病毒性腦炎患兒T細胞免疫功能降低，CD4+是具有輔助性T細胞亞群，它可以刺激B細胞產生抗體，可以分為Th1和Th2兩種類型，它們通過所分泌的細胞因子相互調節，正常情況下，二者處于相對平衡狀態以維持機體免疫功能的平衡，當機體受到異常抗原刺激時，上述平衡被打破，可引起異常的免疫應答。Th1主要參與細胞免疫，其分泌的IL-2和TNF-α是其特征因子。Th2 細胞主要刺激B細胞產生抗體，參與體液免疫，維持著機體細胞免疫和體液免疫正常的功能，其主要分泌IL-6、IL-10等細胞因子。本研究結果顯示，病毒性腦炎患兒重型組和輕型組CD4+T淋巴細胞比對照組降低，其中Th1類細胞因子IL-2和TNF-α升高，Th2類細胞因子IL-6、IL-10也升高，其水平重型組高于輕型組，輕型組高于對照組，治療前高于治療后，我們分析過病毒性腦炎患兒盡管Th細胞減少，但免疫狀態異常，Th1和Th2類細胞因子同時升高，Th1/Th2比例失衡在其炎性反應中起著重要作用。有研究表明病毒性腦炎的發生是Th1型細胞和Th2型細胞相互作用、相互反饋的過程[6，7]，病毒侵犯中樞神經系統時，活化的免疫細胞釋放IL-2、TNF-α、IL-6、IL-10等細胞因子，其分泌不平衡，不能維持Th1/Th2平衡，機體的促炎能力強于抑炎能力，對腦組織造成損害；也有報道病毒感染產生的TNF-α、IL-2、IL-6、IL-10對未感染細胞是一種保護機制，促使機體建立抗病毒狀態,阻止病毒擴散，我們分析其在病毒性腦炎中也起到了抗病毒作用[8]。另一方面IL-2、TNF-α、IL-6、IL-10水平和病情輕重及轉歸密切相關，這與國內相關報道一致[9]。另外，本研究中重型組和輕型組IL-2水平均較對照升高,重型組又高于輕型組，其水平隨著病情加重而升高，間接反映了腦損傷的嚴重程度，但IL-2自身并不具有抗病毒的功能，可能是IL-2與TNF-α、IL-6、IL-10構成了炎癥因子系統,共同參與腦組織神經元損傷過程。有研究表明TBEV菌株感染后的小鼠腦組織IL-2 水平顯著升高[10]，IL-2對T細胞增殖有影響，外周感染TBEV后，外周組織如淋巴結和脾臟發生原發性T細胞活化，然后TBEV進入中樞神經系統后，T細胞浸潤腦部感染部位，提示IL-2是重癥腦炎致病關鍵因素。本研究中重型組CD8+T、CD19+B淋巴細胞較輕型組與對照組顯著升高(P<0.05)，CD8+T細胞代表細胞毒性T 細胞和抑制性T細胞，主要發揮特異性殺傷靶細胞的功能，從而引起靶細胞的溶解與凋亡，有利于病毒的清除，但同時這種特異性殺傷靶細胞的功能若過度激活，也對腦組織損害造成嚴重損害，有報道稱CD8+T淋巴細胞介導的細胞毒性反應可能是單純皰疹病毒性腦炎患者的腦損傷的重要病因[11];CD19+是B淋巴細胞表面標志分子，其在病毒性腦炎患兒中升高，與Atkinson等[12]報道一致，我們分析B淋巴細胞活化分化成熟為漿細胞，并分泌產生自身抗體，從而引起神經組織的損傷，這是病毒性腦炎患兒的重要發病因素。重型組和輕型組CD16+CD56+比對照組明顯升高，CD16+56+代表的自然殺傷細胞(NK 細胞)是機體的第一道防御屏障，在清除病毒感染中起重要作用，病毒性腦炎患兒中其表達升高;我們推測患兒病毒刺激后應激能力增強和其發病有關。但病毒性腦炎患兒重型組CD4+/CD8+比值較輕型組與對照組明顯降低，我們推測二者的免疫平衡功能紊亂在該疾病過程中起重要作用。CD4+CD25+調節性T細胞在機體的免疫調節中發揮作用，可通過調節Th1/Th2平衡，抑制Th2細胞的分化而強化Th1細胞的活性。本試驗中重型組和輕型組淋巴細胞CD4+CD25+較對照組明顯降低，我們推測CD4+CD25+減少對Th2 抑制作用減弱，導致Th1/Th2失衡，可能是病毒性腦炎發生的原因之一，有報道稱病毒性腦炎中CD4+CD25+調節性T細胞存在缺陷[13]。

本研究結果顯示，病毒性腦炎患兒治療后CD3+、CD4+/CD8+較治療前升高，CD8+、CD19+較治療前降低，治療前后比較有統計學意義。CD3+治療后升高，表明T細胞免疫功能在升高；CD4+/CD8+比值在治療后升高，我們推測二者的免疫平衡功能在病情好轉時恢復，這對疾病預后有重要提示意義；CD8+細胞殺傷作用能夠清除病毒，治療后病毒載量減少，其激活也減少，同時也減輕了因其過度激活對正常腦細胞的損害[11]；CD19+分泌的抗體是病毒性腦炎患兒腦損傷的重要因素，治療后對抗原的特異性識別減少，產生抗體也相應減少，因此B淋巴細胞水平下降，體液免疫功能恢復。雖然治療后CD4+、CD16+CD56+、CD4+CD25+和治療前比較差異不明顯，可能與樣本量和預后分組有關系，但也是在趨向好轉，我們分析淋巴細胞亞群水平和病情密切相關，治療后免疫功能的恢復有助于疾病的恢復。本研究中治療后IL-2、TNF-α、IL-6、IL-10水平較治療前明顯降低，我們分析病毒性腦炎發病時病毒感染中樞系統引起炎癥反應，這一過程產生了IL-2等細胞因子，應用糖皮質激素等藥物進行治療后炎癥反應被抑制，這些細胞因子含量也減少。

綜上所述，病毒性腦炎的發病及預后與T、B 淋巴細胞和NK 細胞功能紊亂及腦脊液IL-2、NF-α、IL-6和IL-10水平相關，其與病情進展的相關性有待擴大樣本進一步研究。