新疆蟠桃葉附生酵母種群結構分析

劉歡, 張媱, 王翀, 孫燕飛, 雷勇輝

新疆蟠桃葉附生酵母種群結構分析

劉歡1, 張媱1, 王翀3, 孫燕飛1, 雷勇輝2,*

1. 石河子大學生命科學學院,石河子 832003 2. 石河子大學農學院,石河子 832003 3. 新疆出入境檢驗檢疫局,烏魯木齊 830063

通過Illumina MiSeq平臺, 對石河子143團兩個蟠桃園所采集的葉片樣本附生酵母菌26S rDNA D1/D2區進行高通量測序, 并分析了其物種的組成、Alpha多樣性以及菌種群落結構。結果顯示,兩個桃園中共檢測到1470個OTU(Operational Taxonomic Units, 操作分類單元), 桃園1中含有個1217個OTU, 桃園2中含有609個OTU, 其中有356個為共有OTU。共鑒定出酵母菌2門22屬, 屬于擔子菌門(Basidiomycota)、子囊菌門(Ascomycota), 兩個桃園共有的酵母屬有線黑粉酵母屬(), 接合酵母屬(), 紅酵母屬(), 隱球酵母屬(),, 畢赤酵母屬(), 假絲酵母屬(),,, 兩個桃園優勢屬均為線黑粉酵母屬。研究結果表明石河子地區蟠桃葉表面附生酵母菌資源豐富, 值得進一步開發與利用。

蟠桃葉; 附生酵母; 高通量測序

0 前言

植物表面棲居有大量的微生物, 但直至上世紀上半葉, 葉面微生物仍為人們所忽視, 相反, 這段時間內對土壤微生物的研究眾多[1–2]{Eaton, 1931 #30;Clark, 1949 #32;TIMONIN, 1941 #31;Waksman, 1922 #33}, 在土傳植物病原菌生物防治的研究方法上取得了很大的進展, 為植物葉部微生物的研究提供了寶貴的研究方法和經驗。近年來, 植物葉部微生物的研究逐漸受到重視[3], 對植物葉片表面的酵母菌的研究也進入研究人員的視線。酵母菌擁有豐富的酶系統和蛋白質, 可以為其他生物體提供營養物質, 可以代謝重金屬或者降解某些難降解的物質, 維持生態環境的穩定[4], 葉片作為植物的營養器官, 為植物提供有機物, 進行蒸騰作用, 對植物有著至關重要的作用。從葉面分離到的許多酵母能夠合成β-吲哚乙酸, 它是一種植物激素, 具有生長素活性[5], 在植物體內, 作為執行細胞通訊的化學信息在代謝、生長、形態建成等植物生理活動的各個方面起著十分重要的作用[6]。本世紀以來, 中外學者逐漸開展了對不同植物葉片酵母菌的研究。R Zvyagilskaya 等人在以色列耐鹽、耐干旱植物濱藜排鹽的葉片表面分離出幾種好氧、中等耐鹽和耐堿酵母[7]。AM Glushakova 等人研究了25種植物葉片表面附生的酵母菌群落結構的季節性動態變化, 指出一般來說植物個體發育周期越長, 植物葉片附生酵母的多樣性越高[8]。。董坤等人的研究結果表明霉菌和酵母菌是普洱茶發酵制作過程中主要微生物種類, 其中, 酵母主要產生酒精和產脂, 對普洱茶的品質、風味形成起主要作用[9]。

蟠桃()是李亞科, 桃的變種, 以其形美、色艷、多汁、味美、汁多甘厚、味濃香溢等特點而馳名海內外, 新疆是蟠桃的原產地, 石河子一四三團的蟠桃屬于蟠桃的極品。一四三團從1955年開始大面積種植蟠桃, 至今已經有60多年蟠桃種植歷史, 該地種植的蟠桃個大、味甜、汁多, 被譽為“人間仙果”[10]。目前, 還未有人對蟠桃桃葉表面附生酵母菌的物種多樣性進行研究, 因此, 我們在一四三團兩個人工種植蟠桃園采集桃葉樣本, 采用近年來興起的Illumina MiSeq高通量測序技術(High-throughput sequencing), 對葉片表面酵母菌26S rDNA D1/D2區域進行測序, 相較于傳統的分子生物學, 高通量測序方法具有準確性高、速度快、成本低等優點[11], 能客觀并且更全面地反應微生物多樣性[12], 可以全面而準確地分析蟠桃葉片表面酵母菌菌群結構, 以了解葉片表面酵母菌菌群的組成特點, 為該地區酵母菌的開發提供參考資料。

1 材料和方法

1.1 桃葉樣本的采集

采樣時間及地點: 2017年8月, 本研究采樣地點為新疆石河子地區一四三團相距10 km的兩個不同桃園, 兩個桃園中樹齡分布均不一致, 在兩個桃園中隨機選取若干長勢良好的桃樹, 在選定的桃樹樹冠分別采取大小均勻、無傷病的葉片各約20 g, 混合均勻, 裝入帶有編號的塑封袋中密封后放入4 ℃冰箱保存。石河子地區一四三團, 地處天山北麓, 位于北緯43°26′—45°20′, 東經84°58′—86°24′之間, 屬于典型的溫帶大陸性高原氣候, 冬季漫長嚴寒, 夏季較短炎熱, 日照充沛, 年日照時數為2721—2818 h, 夏季平均溫度在25.1 ℃—26.1 ℃之間、降水量在125.0—207.7 mm之間。

1.2 桃葉基因組DNA提取以及MiSeq測序

分別將兩個桃葉樣本與無菌水按1: 2比例置于錐形瓶中, 搖床6 h后將桃葉在無菌條件下過濾, 留下過濾后的液體用0.45 μm的濾膜進行抽濾, 提取抽濾后濾膜上的DNA, 送至上海派森諾生物科技有限公司對樣品的26S rDNA D1/D2區進行高通量測序, 使用帶Barcode的26S rDNA特異引物NL-1 (5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′)和NL-2 (5′-CTTGTTCGCTATCGGTCTC-3′), 測序使用Illumina (MiSeq)平臺。

1.3 生物信息學分析

下機數據經過預處理, 去除低質量reads, 根據PE數據之間的overlap關系將成對的reads拼接成一條序列, 去除tags兩端的Barcode序列及引物序列, 去除嵌合體及其短序列等后得到優化序列。拼接過濾后的優化序列, 在97%相似度下利用QIIME (v1.8.0)軟件將其聚類為用于物種分類的OUT (Operational Taxonomic Units), 以對獲得的序列進行OTU歸并劃分, 每個OTU的代表序列用于分類地位鑒定, 統計各個樣品每個OTU中的豐度信息, OTU的豐度初步說明了樣品的物種豐富程度。

1.4 Alpha多樣性分析

對新疆石河子地區蟠桃葉高通量測序結果進行α多樣性的相關分析,基于OTU結果, 計算Shannon指數, Chao 1指數, 譜系多樣性共3個指數來進行生物多樣性分析, 樣本在群落的豐富度和均勻度與指數值為正相關關系[13]。豐富度指數(Chao 1、ACE)和多樣性指數(Shannon)的計算利用Mothur 1.30.1軟件完成。

1.5 物種組成分析

獲得的OTU與RDP數據庫(Release 11.1, http:// rdpcme.msu.edu/)比對, 通過RDP Classifier鑒定OTU代表性序列的微生物分類地位。各組樣品在不同水平的分類比較柱形圖是根據QIIME (v1.8.0)軟件計算結果用Origin 9.0軟件繪制。

2 結果與分析

2.1 OTU水平分析

利用Illumina Miseq測序平臺對2個樣品進行測序, 經過數據前處理, 得到的測序長度集中在230—340 bp之間。兩個樣品共產生4902個OTU, 原始OTU豐度矩陣中豐度值低于全體樣本測序總量0.001%(十萬分之一)的OTU可能是由于測序錯誤造成的, 將這部分OTU去除, 不加入后期分析, 故兩個樣品的OTU數為1470個。2個樣品的OTU分類結果(表1)顯示, 桃園1(L1)與桃園2(L2)所測得的OTU在各個分類水平上均有明顯差異, 桃園1 OTU在各個分類水平上的相對豐度遠高于桃園2。通過Venn圖(圖1)可以顯示桃園1特有OTU 861個, 桃園2特有OTU 253個, 兩個桃園共有OTU 356個,表明桃園1與桃園2 OTU水平有明顯差異, 桃園1中特有OTU數目遠高于桃園2。

2.2 Alpha多樣性分析

在當前的測序量下, 每個桃葉樣本的Shannon曲線與Chao 1曲線(圖2)都接近平臺期, 這表明選取的樣本測序量能夠充分反映待測樣本真菌菌群結構的合理性及多樣性。

兩個樣本中真菌Alpha多樣性指數存在明顯差異(表2), 桃園1中真菌豐富度指數Chao 1和ACE指數遠大于桃園2, 說明L1中蟠桃葉附生真菌群落更為豐富。真菌多樣性指數Shannon指數分別為6.28和5.59, L1多樣性指數高于L2, 說明L1中真菌多樣性高, 真菌種類較多, 且均勻度較好, 而L2中真菌種類較少, 群落多樣性較低, 均勻度稍差, 優勢菌更加明顯。

表1 樣品OTU分類結果統計

圖1 樣品共有OTU維恩圖

Figure 1 The venn diagram of the shared OTU graph of samples

圖2 Shannon指數(A)和Chao 1指數(B)曲線分析圖

Figure 2 Shannon index(A) and Chao 1 index(B) curves in the samples of leaves of flat peach

表2 蟠桃葉附生真菌的生物多樣性指數

2.3 桃葉附生酵母菌種群結構組成分析

獲得的酵母OTU與RDP數據庫比對, 通過RDP Classifier鑒定, 可以獲得樣本中酵母菌在各分類水平的具體組成(表3)。類群數統計結果表明, 兩個桃園桃葉附生酵母在門綱目科屬水平上數目相差不大, 但在種水平上, 桃葉1與桃葉2附生酵母菌分別有72和51種, 桃葉1酵母菌類群數相對豐度高于桃葉2。

兩個桃葉樣本表面附生的酵母菌菌群組成既有共性, 又存在一定差異(圖3)。圖3A為兩個樣本在門分類水平上的組成結果, 桃葉1中的擔子菌門(Basidiomycota)占酵母菌菌群57.6%, 子囊菌門(Ascomycota)占酵母菌菌群42.4%, 而桃葉2中的擔子菌門占酵母菌菌群52.5%, 子囊菌門占酵母菌菌群47.5%。在屬分類水平上(圖3B), 桃葉1和桃葉2分別包含有15個和16個酵母屬, 但屬的種類有差異, 兩個桃園共包含22個屬。其中兩個桃園共有的屬有9個, 為線黑粉酵母屬(), 接合酵母屬(s), 紅酵母屬(), 隱球酵母屬,, 畢赤酵母屬(), 假絲酵母屬(),,, 他們在桃園1和桃園2中所占比例分別為76.65%和90.06%, 8.38%和0.28%, 7.98%和0.83%, 2.80%和1.38%, 1.20% 和0.55%, 1.00%和0.83%, 0.20%和1.10%, 0.20%和0.83%, 0.20%和0.55%。兩個桃園樣本均以線黑粉酵母屬() 為優勢屬, 圖3B中顯示桃園1相比桃園2酵母屬的分布更加均勻, 桃園2線黑粉酵母屬優勢更加明顯。

桃園1中有6個特有屬: 棍孢屬() 0.40%, 梗孢酵母屬()0.20%, 三角酵母屬()0.20%,0.20%, 兔糞酵母屬()0.20%, 海洋嗜殺酵母() 0.20%; L2中有7個特有屬:1.10%,0.55%, 擲孢酵母屬() 0.55%, 裂殖酵母屬()0.55%, 雙足囊菌屬()0.28%,0.28%, 梅奇酵母屬()0.28%(圖3B)。由此可見, 兩個桃園中特有的種屬種群數量都不是很高。

3 討論

本實驗基于Illumina MeSeq平臺, 采用26S rDNA D1/D2區域序列高通量測序, 首次對石河子一四三團兩個蟠桃園內桃葉表面酵母菌群進行了分析, 探索了蟠桃桃葉表面酵母菌的種群結構及多樣性。引物NL1和NL4是酵母菌測序的通用引物, 但對于高通量測序而言片段過大, 故本研究采用引物NL1和NL2, 通過該引物測序, 兩個桃葉樣本獲得了酵母菌共2門22屬, 在門分類水平上, 兩個樣本都集中在擔子菌門和子囊菌門, 在屬分類水平上, 桃葉1和桃葉2分別包含有15個和16個酵母屬, 結果表明該引物對酵母菌有一定的特異性, 但除了酵母菌外, 還檢測到其他非酵母真菌, 如小球腔菌屬()、分子孢子菌屬()和曲霉屬()等, 因此本實驗數據分析時候要剔除非酵母菌物種。林建春等人使用高通量測序方法研究清香型白酒發酵中酵母種群結構時, 先提取酒醅宏基因組, 之后對細菌、酵母和霉菌進行熒光定量, 高通量測序時所用的引物為真菌的ITS2區域的ITS3(5'-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3')和ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')[14], 關于酵母菌高通量測序特異性引物的選擇需要進一步進行研究。此外, 在種的分類水平上, 兩個桃葉1與桃葉2分別獲得了72和51個酵母種, 結合所分離的可培養酵母菌種類(未發表)來看, 石河子地區蟠桃桃葉附生酵母菌種群數量十分可觀, 還有很多酵母菌資源值得我們進一步分離、開發。

表3 各分類水平的酵母菌類群數統計

圖3 門分類水平(A)和屬分類水平(B)豐度分布柱狀圖

Figure 3 Histogram of fractional abundance in phylum and genus classification levels

此次兩個采樣地點距離較近, 所處生態環境相似, 而測序結果兩個桃園樣本酵母菌種群結構雖有一致性, 但也存在差異, 均發現了特有的酵母屬, 可能是由于酵母菌所處的微環境不同, 推測其具體原因主要為桃園管理方式的不同, 桃園1管理良好, 桃樹長勢很好; 桃園2中雜草叢生, 田管處理不是很好, 桃園1與桃園2相比環境更加穩定, 外界干擾較小, 故桃園1酵母菌種群相對呈現出更強的均勻性, 此外, 施肥、澆水、土壤等天然條件也可能是導致酵母菌種類不同的原因。從高通量測序結果來看, 兩個桃園樣本中所占比例較大的酵母屬有線黑粉酵母屬, 接合酵母屬, 紅酵母屬, 隱球酵母屬。線黑粉酵母屬主要位于植物體內及表面, 高原湖泊也有分布, 有研究表明黑粉酵母菌可以產生α-淀粉酶等多種胞外酶[15], 目前對于微生物胞外酶的研究已經取得了明顯的成就, 微生物由于其多樣性、可再生性和對遺傳操縱的敏感性, 顯示出巨大的產酶潛力[16], 進一步研究有助于疾病控制, 社會生態環境平衡[17], 具有廣泛應用前景。研究報道發酵性接合酵母有較強的富硒能力, 生產中可將富硒酵母制成飼料補充動物體內硒的含量, 降低死亡率, 改善繁殖性能等[18]。紅酵母屬酵母菌是世界各大洋和中國海的優勢菌[19], 在空氣中經常出現, 海藻、樹葉、木片等基物中也有分布。紅酵母菌發酵可以生產天然的β-胡蘿卜素[20], 可以有效保護細胞內生物大分子不受自由基的損傷、維持正常生命代謝、防治衰老和癌癥, 利用紅酵母提取色素簡單方便, 成本低廉[21], 具有很大的實用價值。隱球酵母菌可以從水果, 果蠅的腸道, 樹皮和與樹結合的苔鮮和地衣中分離到。相光明等人對隱球酵母菌高效產脂發酵條件進行了研究[22], 微生物產脂具有油脂含量高、生產成本低、可連續生產、周期短、不受季節和氣候影響的優點, 產品可用于制取生物柴油、類可可脂及高檔食用調和油等[23], 高值化潛力大, 具有廣闊的工業化應用前景, 可以由此開辟新的油脂資源。因此, 本研究對桃園酵母菌資源進一步開發利用奠定了一定的理論基礎。

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Community structure analysis of yeast attached to flat peach leaves in Xinjiang

LIU Huan1, ZHANG Yao1, WANG Chong3, SUN Yanfei1, LEI Yonghui2,*

1. College of Life Sciences, Shihezi University, Shihezi 832003, China 2. Agricultural college of Shihezi University, Shihezi 832003, China 3. Xinjiang Entry & Exit Inspection and Quarantine Bureau, Urumqi 830063, China

To study the structural diversity of the epiphytic yeasts isolated from leaves of flat peach in Shihezi, we used 26S rDNA Illumina Miseq high-throughput sequencing method to analyze the composition of species, the Alpha diversity and the composition of yeast community structure of epiphytic yeasts which were isolated from the fresh leaves of tow flat peach orchards in Shihezi.The result showed that a total of 1470 OTU(Operational Taxonomic Units) were detected through 26S rDNA high-throughput sequencing. There were 1217 OTU in orchard 1 and 609 OTU in orchard 2, among which 356 OTU were shared. All yeasts were classified into 2 plylums and 22 genus in the two samples by identification. Basidiomycota and Ascomycetes were the dominant plylums of both tow flat peach orchards. The shared genus of tow samples were,,,,,,,and. The dominant genu of two samples wasIn conclusion, we know that there are abundant yeast resources on the surface of flat peach leaves in Shihezi area, and it is worthy of further study for exploitation and utilization.

flat peach leaf; epiphytic yeast; high-throughput sequencing

10.14108/j.cnki.1008-8873.2019.04.005

Q938.1

A

1008-8873(2019)04-029-06

2018-06-07;

2018-08-28基金項目:國家自然科學基金項目(31860003)

劉歡(1998—), 女, 山西運城人, 主要從事微生物資源研究, E-mail: 1042441810@qq.com

雷勇輝(1978—), 男, 碩士, 主要從事生物學研究, E-mail: 497976@qq.com

劉歡, 張媱, 王翀, 等. 新疆蟠桃葉附生酵母種群結構分析[J]. 生態科學, 2019, 38(4): 29-34.

LIU Huan, ZHANG Yao, WANG Chong, et al. Community structure analysis of yeast attached to flat peach leaves in Xinjiang[J]. Ecological Science, 2019, 38(4): 29-34.