人脫細胞羊膜與家兔骨髓間充質干細胞構建組織工程骨膜的體外實驗研究

肖正俊，阿良，李洪秋，鄧純博

（沈陽醫學院附屬中心醫院 骨外2 科，遼寧 沈陽 110024）

目前，國內外有三種方法治療骨缺損[1，2]，具體如下：⑴自體骨移植、異體骨移植和異種骨移植。但自體移植存在供區來源有限，且對供區造成損傷，給患者帶來一定的痛苦；異體和異種骨移植會引起免疫排斥反應和傳播疾病等并發癥；⑵骨延長術[3-5]在延長骨的同時也有利于缺損軟組織的修復，顯示了其在治療創傷性復雜骨缺損的優越性。治療周期長，患者活動不便，可能發生針道感染、松動及斷裂等是該項技術的主要不足；⑶誘導膜技術（Masquelet 技術）[6-8]為大段骨缺損治療帶來了新的曙光，其存在治療周期長和二次手術的缺點。我們擬定利用羊膜構建組織工程骨膜，體外檢測其可行性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及材料

實驗動物：成年家兔2 只，用于分離培養骨髓間充質干細胞和建立家兔大段骨缺損研究模型，沈陽醫學院附屬中心醫院實驗中心提供。健康人羊膜：由沈陽醫學院附屬中心醫院產科提供。

1.2 實驗器材

冷凍干燥機（英國LANCD 型號）；純水機（法國Millipore）；Ph 計（美國 Orion）；超低溫冰箱（日本SANYO）；微量移液槍（美國 Sigma）；水浴箱（中國蘇州柏西瓦爾）；培養板（美國Costar）；臺式離心機（美國Sigma）；漩渦振蕩器（中國北京優晟）；超凈工作臺（中國上海祺享智能科技有限公司）；電子天秤（中國北京西杰）；照相顯微鏡（日本Olympus）；倒置顯微鏡（日本Olympus）；CO2培養箱（美國Thermo Forma）；掃描電鏡（SEM）（荷蘭 QUANTA200 Philips）。

1.3 實驗方法

1.3.1 家兔的骨髓間充質干細胞的分離培養及傳代

首先在無菌條件下應用剪刀和鑷子分離出家兔的脛骨，去除肌肉等軟組織，用5 mL 注射器抽取培養基沖洗骨髓，制成單細胞懸液。調節離心機每分鐘1 200 轉持續5 min 后，棄上清液。選取含有L-DMEM及10%FBS 混合懸細胞，接種到25 cm2的培養瓶中，溫度為37℃、含5%CO2的培養箱中，間隔2～3 d 更換培養液，于倒置相差顯微鏡下觀察細胞的生長情況及附壁情況，4～6 d 細胞80%～90%相融合。細胞傳代時，倒棄培養液，PBS 緩沖液清洗3 次，加入0.1%EDTA-Na2與0.25%胰酶消化液約2 mL，用力均勻搖動培養瓶，使細胞表面均有消化液漫過，2～4 min 后，鏡下觀察細胞變形回縮，棄消化液，滴入血清培養基，用吸管輕輕吹打附于細胞的管壁，細胞懸液就此形成。根據計數板上計出細胞數的多少，將細胞懸液按 1∶2.5 用含 L-DMEM 及 10% FBS 稀釋至4～6 mL，接種到25 cm2的培養瓶中，并置于溫度為37℃、含5%CO2的培養箱中，進行傳代培養并于顯微鏡下觀察，重復上述方法并傳至第三代家兔的骨髓間充質干細胞[9]。

1.3.2 家兔骨髓間充質干細胞的成骨誘導分化鑒定

取第三代家兔骨髓間充質干細胞約2～3×104個細胞/孔密度接種在6 空板血蓋片中，H-DMEM 完全培養基24 h 后換作成骨誘導液，每2～4 天換液一次，第4 周行鈣結節茜素紅染色。用PBS 緩沖液沖洗2～3 次，75%乙醇固定12 min，雙蒸水沖洗4 次；0.1%茜素紅Tris-HCL37℃，30 min；蒸餾水沖洗、干燥、快干膠封片[10]，顯微鏡下觀察并采圖。

1.3.3 人脫細胞羊膜的取材、處理及保存方法

⑴人脫細胞羊膜的取材與處理[11]：胎盤與胎兒分離后立即取胎盤置于無菌盒中，無菌條件下用生理鹽水沖洗凈胎盤上的血凝塊，通過羊膜與絨毛膜間的潛在間隙鈍性分離獲取羊膜，用無菌PBS 緩沖液洗凈羊膜殘留組織與血塊等雜質，抗生素生理鹽水（含慶大霉素1 000u/mL、兩性霉素B 2.5 μg/mL）浸泡 20 min，0.25%胰酶消化 24 h，PBS 緩沖液沖洗 4～5 次。將人脫細胞羊膜平鋪于無菌濾紙片上，上皮面朝上，剪成20 mm×20 mm 小塊，隨機分成三組備用。

⑵人脫細胞羊膜的保存方法[12]：將人脫細胞羊膜連同濾紙片按下述方法保存，使用前用無菌PBS緩沖液浸泡15 min。

方法一：Hank’s 平衡鹽/ 甘油溶液深低溫保存：將人脫細胞羊膜片放入裝有4 mL 滅菌Hank’s平衡鹽/甘油溶液(Hank’s 平衡鹽溶液與甘油體積比為3∶1)的中性硅玻璃瓶中，封閉瓶口，-80℃環境保存，使用前室溫自然解凍。此方法保存人脫細胞羊膜6 個月時細胞基本完整和連續。

方法二：純甘油4℃保存：將人脫細胞羊膜片放入裝有4 mL 滅菌純甘油的中性硅玻璃瓶中，封閉瓶口，4℃冰箱保存。此方法保存人脫細胞羊膜3 個月時細胞就出現嚴重皺縮形態，結構模糊。

將人脫細胞羊膜固定后行HE 染色，觀察細胞是否去除干凈；掃描電鏡下觀察人脫細胞羊膜的結構特征。

⑶家兔骨髓間充質干細胞負載于人脫細胞羊膜上的生長曲線檢測：取成年家兔骨髓間充質干細胞第三代，將細胞濃度調整為6×103/mL，種植到48 孔板中，其中24 孔板內為提前浸泡無血清培養基的人脫細胞羊膜，另24 孔板內為提前浸泡無血清培養基的無材料組，每孔各加入0.5 mL 第三代家兔骨髓間充質干細胞懸液。從第二天起，每天相同時間取6孔加入濃度為4 g/L 的四氮唑鹽溶液40 μL，約在37℃下孵育4 h，停止培養細胞，棄上清液后，每孔再加入300 μL DMSO，震蕩10 min 后，將上清等量吸出到96 孔板中，510 nm 波長測每孔吸光度，并計算6孔的平均值，橫軸表示時間，縱軸代表光吸收值，繪制生長曲線。

⑷家兔骨髓間充質干細胞負載于人脫細胞羊膜并成骨誘導培養：消化收集第三代家兔骨髓間充質干細胞，調節離心機每分鐘1 200 轉離心，調整細胞密度為2×106/mL，使用微量移液器滴加到24 孔板中的人脫細胞羊膜上（大小為1.5 cm×1.5 cm），每片200 μL 均勻涂抹。將培養板在 37℃、5%C02、飽和濕度條件下靜置3 h，使細胞附著于人脫細胞羊膜上，再加入1 mL 成骨誘導液 (包含地塞米松8～10 mmol/L，10%胎牛血清，VitC 50 mg/L，高糖 DMEM，β-磷酸甘油鈉10 mmol/L)培養，對照組不加入成骨誘導液，每2～4 天更換一次培養液。定期觀察及檢測對照組及實驗組的標本。大體觀察：家兔骨髓間充質干細胞負載于人脫細胞羊膜培養后定期從培養孔內生物材料取出，直視下觀察加成骨誘導劑及未加成骨誘導劑的復合而成的組織工程骨膜材料的顏色、性狀、質地。組織學觀察：家兔骨髓間充質干細胞負載于人脫細胞羊膜培養后定期從培養孔內生物材料取出，4%多聚甲醛固定，石蠟塊進行包埋，組織學切片，行HE 染色，顯微鏡下觀察組織工程骨膜。掃描電鏡(SEM)觀察：家兔骨髓間充質干細胞負載于人脫細胞羊膜培養后定期從培養孔內生物材料取出，按照2.5%戊二醛固定，使用酒精脫水，醋酸異戊酯作工作液等步驟，臨界點干燥，表面噴金后上機觀察家兔骨髓間充質干細胞在人脫細胞羊膜上的黏附、生長、分化、增殖情況。鈣結節染色檢測(茜素紅染色、Von kossa 染色)：家兔骨髓間充質干細胞負載于人脫細胞羊膜復合培養后定期從培養孔內生物材料取出，行鈣結節茜素紅染色。將標本用PBS 緩沖液沖洗2～3 次，使用75%乙醇固定10 min，再用雙蒸水沖洗4～5 次，最后于 37℃下用 0.1%茜素紅 Tris-HCl（PH 8.3）30 min 染色；雙蒸餾水沖洗、干燥、快干膠封片，顯微鏡下觀察并采集圖片。定期取出復合的組織工程骨膜材料后，先使用4%多聚甲醛固定標本，5%硫代硫酸鈉孵育30 min，蒸餾水沖洗，然后再使用1%硝酸銀溶液紫外線下染色30 min，雙蒸餾水沖洗掉細胞表面的黑色物質，最后使用5%硫代硫酸鈉染色2 min 及1%中性紅復染10 min，雙蒸餾水漂洗后觀察標本并采集圖片。主要觀察內容及指標：家兔骨髓間充質干細胞的形態及鑒定。HE 染色及掃描電鏡下觀察人羊膜脫細胞的結構特點。家兔骨髓間充質干細胞負載于人脫細胞羊膜上的生長曲線的檢測（MTT）。HE 染色及掃描電鏡下觀察家兔骨髓間充質干細胞負載于人脫細胞羊膜上的附著、生長、及增殖情況。

1.4 統計學方法

通過組間F檢驗其差別。

2 結果

2.1 倒置相差顯微鏡下觀察家兔骨髓間充質干細胞的形態

培養48 h 后細胞開始貼壁生長，出現纖維樣細胞形態，大小不一細胞集落逐漸增多，72 h 后基本全部貼壁生長，緊密排列，細胞集落及增生灶不斷增加，細胞呈長梭形，其形態發生了本質性的變化。培養3～4 d 后細胞增殖加快，90%左右的細胞開始融合，形成片，并呈現出多變性的體型。一周細胞生長鋪滿95%的瓶底，平行排列成“螺旋”狀或“旋渦”狀，細胞核明顯、清晰，核漿比例增大。第1～2 代細胞間的貼壁和生長速度無明顯區別，呈比原代更均勻的長梭形，細胞間隔更均勻，傳至第三代時無明顯變化。其中傳代1～2 d 為潛伏生長期，3～6 d 為對數增殖期，對數增殖期結束后進入平臺期和下降期。如圖1-3 所示為家兔骨髓間充質干細胞形態學圖片。

圖1 原代細胞

圖2 第三代細胞

圖3 酶處理后的細胞

2.2 家兔骨髓間充質干細胞誘導分化為成骨細胞的檢測結果

家兔骨髓間充質干細胞經成骨誘導液培養，顯微鏡下可見其細胞聚集成團生長，誘導至2 周左右倒置相差顯微鏡下可見集落生長的細胞群體，呈“旋渦”團狀向四周放射生長，形成多個分布不均、大小不一、形態各異的鈣素結節，逐漸增大，3 周后被茜素紅染成玫瑰紅色。圖4 所示成骨細胞檢測的結果。

2.3 人脫細胞羊膜的觀察

經物理及化學等方法處理獲得的人脫細胞羊膜呈淺乳白色半透明狀膜，冷凍干后的人脫細胞羊膜成白色紙狀，其表面略顯粗糙。經物理及化學等方法處理獲得的人脫細胞羊膜，HE 染色及掃描電鏡下觀察顯示大量的粉紅色膠原細胞外基質，呈網狀交錯分布，沒有破壞其結構和成分，未見有細胞形態的結構（圖5-7）。

2.4 家兔骨髓間充質干細胞負載于人脫細胞羊膜上的生長曲線

檢測家兔骨髓間充質干細胞負載于人脫細胞羊膜（實驗組）及無人脫細胞羊膜（對照組）上增殖情況，接種后第2 天細胞開始增殖，第3 天細胞進入快速增長期，前4 d 實驗組及對照組細胞增殖速度無統計學意義（F＞0.05）。對照組第5 天達到了細胞增殖的高峰，實驗組第7 天細胞達增殖高峰，爾后增殖呈下降趨勢。其中第3 天、5 天實驗組與對照組增殖細胞量的組間F檢驗具有統計學意義（F＜0.05），對照組增殖細胞量比實驗組少；第5 和第7 天兩組增殖細胞量通過組間F檢驗顯示具有統計學意義（P＜0.01），對照組增殖細胞量比實驗組少（表1）。

表1 兩組增殖細胞的比較

與無人脫細胞羊膜組相比，F＜0.05，具有統計學意義，說明家兔骨髓間充質干細胞可以在人脫細胞羊膜上生長及增殖，比無人脫細胞組的細胞增殖量更多，并且為細胞提供了良好的生長空間及環境。

2.5 家兔骨髓間充質干細胞負載于人脫細胞羊膜并成骨誘導培養

對照組中體外復合培養見家兔骨髓間充質干細胞粘附于人脫細胞羊膜，細胞增殖良好。肉眼觀察復合而成的組織工程骨膜材料的顏色和組織硬度不變，并且電鏡下觀察未見有大量的成骨組織形成。實驗組體外復合培養見家兔骨髓間充質干細胞粘附于人脫細胞羊膜，分泌大量的細胞外基質，有大量的細胞分化及增殖。肉眼觀察復合復合而成的組織骨膜材料的顏色變白，組織硬度增加，電鏡觀察見有大量的成骨組織形成。鈣結節茜素紅染色（+），鈣結節Vonkossa 染色（+）（圖8，9）。

3 討論

目前臨床已有多種技術修復大段骨缺損，但各種技術都有其局限性，如自體骨移植存在額外手術創傷、骨質吸收、移植骨數量有限、形態不滿意、供區并發癥等問題；同種異體骨移植存在傳播疾病風險；誘導膜技術要求受區有良好的軟組織條件，需二次手術取出骨水泥、植入自體松質骨。在大段骨缺損的修復過程中，對局部環境有嚴格的要求：⑴骨缺損區域的機械穩定環境，如外固定架、髓內針、鋼板等固定技術；⑵成骨細胞及多種誘導分子，如β-轉化生長因子（TGF-β）、胰島素樣生長因子-Ⅰ、Ⅱ（IGF-Ⅰ，Ⅱ），骨形態發生蛋白（BMP）、成纖維細胞生長因子。在成骨過程中，誘導因子可使聚集的前體細胞定向分化為成骨細胞及血管祖細胞，促進細胞增殖、遷移過程及血管化進程及成骨細胞黏附增殖；⑶阻止缺損處纖維組織長入，如缺損處植骨、骨水泥、鈦網、生物膜等。

圖4 骨髓間充質干細胞成骨的鑒定

圖5 人脫細胞羊膜

圖6 HE 染色圖片

圖7 電鏡下觀察

圖8 BMSCs 與HAAM復合培養5 d

圖9 BMSCs 與HAAM 復合培養7 d

骨膜是皮質骨外表面的纖維狀血管膜，作為祖細胞的重要貯存之一，在骨形成和再生中起著重要作用。該膜由兩層膜組成：包含成纖維細胞的纖維層和包含多能間充質干細胞和成骨細胞的內層。此外骨膜是局部生長因子的來源，如VEGF 和BMP-2，一些體內研究顯示，當骨膜被移除時，骨修復受到顯著影響。其他研究表明骨膜細胞在自體皮質骨移植物的愈合中具有關鍵作用，并且骨膜自體移植物可以促進骨折愈合。

羊膜位于胎盤的最內層，多個體外實驗已經表明人羊膜具有成骨特性，BMP-2 已經在足月新生兒未分化的人羊膜中被檢測到，這種生長因子可誘導間充質干細胞向成骨細胞的分化以及內皮細胞和宿主成骨細胞的增殖和遷移。研究表明，羊膜提取物或羊膜/絨毛膜提取物中含有與成骨有關的生長因子，如成纖維細胞生長因子和轉化生長因子，它們可能促進MG-63 細胞的成骨分化。人脫細胞羊膜與家兔骨髓間充質干細胞聯合應用時，我們看到大量新生的骨組織，骨組織內可見血管網及不規則髓腔。

骨膜和人羊膜具有若干相似的特征，包括干細胞的存在、生長因子、體外證明的成骨能力，二者都具有滲透性；然而，重要的是要表明骨膜血管化程度很大，而HAAM 是無血管的。一些研究發現骨骼肌（肌動蛋白）分泌的可溶性因子影響骨代謝。肌肉也是促進骨愈合的細胞和生長因子的重要來源。在骨膜處植入人羊膜可作為肌肉-骨骼間的屏障，使肌動蛋白不能在組織之間移動，此外，⑴羊膜通透性良好，允許營養因子及組織液通過；⑵羊膜在骨缺損周圍形成機械屏障阻止組織長入；⑶羊膜本身具有干細胞及多種生長因子；⑷羊膜抗原性低，不引起排斥反應；⑸羊膜易于獲得，術中操作簡單。可見，羊膜本身就是一種良好的生物材料[13]，HAAM 材料屬于可吸收膠原類材料，能夠作為種子細胞的支架復合構成組織工程骨膜，為臨床應用修復骨缺損帶來了曙光[14]。

BMSCs 具有多向分化及自我復制的能力[15]，雖是非造血干細胞，但是在應激等一定的條件刺激及誘導下可以分化為成熟的細胞，如軟骨及成骨細胞，供臨床及科研的應用，并且免疫原性較低。兩者相結合，提供適宜的環境，不改變細胞相容性和人脫細胞羊膜原本的特性，置于骨缺損區域誘導成骨的生長。

組織工程骨膜有良好的生物降解性、透明性等特性，作為修復大段骨缺損的材料有其獨特的優越性。骨組織工程技術是將種子細胞經過體外培養，復合于支架材料，然后將細胞-支架復合體植入體內骨缺損部位。在誘導分子的作用下，前體細胞聚集、增殖、分化、黏附，進而實現成骨過程。