草酸誘導哈密瓜采后耐冷性的轉錄組構建與分析

王 靜,劉彩紅,呂 卓,張 輝,胡慧慧

(新疆農業大學食品科學與藥學學院,新疆烏魯木齊 830000)

哈密瓜(CucumismeloL.)屬于葫蘆科黃瓜屬甜瓜亞屬的一個變種。因其味道鮮美、酥脆、營養豐富成為世界上最受歡迎的果實之一[1]。由于哈密瓜果實采后衰老迅速,低溫貯藏通常被用來延長果實的保質期。但哈密瓜屬于冷敏性果實,在低溫環境中易發生冷害(CI)。果實的表皮出現大量的褐色凹陷斑塊,這是哈密瓜冷害的典型癥狀[2-4]。對哈密瓜耐冷性方面的研究主要集中于抗氧化活性[3]、耐冷基因的克隆[5]和與低溫脅迫相關轉錄因子CBFs的表達[6]等,而對于其他方面的研究報道較少[7]。目前轉錄組測序仍然是發現新基因的有效工具[10-11]。因甜瓜基因組相對較小,形態、生理生化特征多樣性等特點引發廣泛關注,已成為研究葫蘆科植物家族基因組學的一個模式植物[8]。2012年甜瓜全基因組測序的完成為研究哈密瓜果實的分子機理提供了良好的基礎[9]。所以為控制哈密瓜果實采后冷害的發展,研究和分析其抗寒性的分子轉錄是有必要的。

有研究報道,熱處理[3]、氣調包裝[12]、NO處理[13]和降低ACC氧化酶表達抑制乙烯合成[14]等手段對哈密瓜采后冷害的發生加以調控。而草酸應用于緩解哈密瓜采后冷害的研究尚未見相關報道。

草酸是一種結構簡單的有機酸,在不同生命體中發揮著不同的作用[15],可提高芒果[16-17]、桃[18]和石榴[19]采后的抗寒性,緩解低溫貯藏的荔枝[20]和杏[21]冷害,延長果實的保鮮期。然而草酸在果實采后抗冷性過程中的作用仍未充分闡明。因此,本文采用15 mmol/L草酸溶液處理“西州密25號”哈密瓜果實,測定果皮的細胞膜滲透率和MDA的含量并對果皮進行轉錄組測序,研究外源草酸誘導哈密瓜果實采后耐冷性的分子機理,為挖掘相關耐冷基因提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

“西州密25號”哈密瓜(厚皮甜瓜亞種CucumismeloL. var. reticulatus Naud)采自吐魯番鄯善縣商品瓜基地,要求瓜中心平均糖度為15%～16%進行采摘,采收時留3～5 cm果柄,挑選瓜皮呈青色,布滿灰色網紋,無傷痕的果實。采后立即用泡沫網狀發套將果實單獨包裝,每個紙箱(40 cm×35 cm×28 cm)中放置4個瓜,于采后4 h內運至新疆農業大學農產品貯運實驗室,選擇成熟度基本一致、大小適中、無任何機械損傷的果實作為實驗材料;三氯乙酸(TCA)、硫代巴比妥酸(TBA)和草酸(OA) 均為分析純,國藥集團上海化學試劑公司;次氯酸鈉 國藥集團上海化學試劑公司;石英砂 國藥集團上海化學試劑公司。

上海雷磁DDS-307型電導率儀(雷磁DJS-1C型電導電極) 上海音孚實業有限公司;SIGMA 3-18K型低溫高速離心機 上海知信試驗儀器有限公司;SP-752型紫外可見分光光度計 上海光譜有限公司;JF2004型電子分析天平 上海麥聚瑞電子儀器有限公司;HH-4型恒溫水浴鍋 國華電器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 哈密瓜選擇及預處理 選擇成熟度基本一致、大小適中、無任何機械損傷的果實作為試驗材料。將挑選好的哈密瓜果實擦拭干凈,浸泡于0.5%的次氯酸鈉水溶液中消毒5 min,取出后用自來水充分清洗3遍,在室溫環境中自然晾干。然后將哈密瓜完全浸泡于15 mmol/L的草酸溶液(0.5 mL/L吐溫-20)中10 min,以蒸餾水(0.5 mL/L吐溫-20)浸泡10 min作為對照組。充分晾干后裝箱,貯藏于3 ℃機械冷庫內。

生理指標的測定分別于處理后第0、7、14、21、28、35、42 d進行取樣,每個處理取3個果實,3個重復,共計9個果實,每個指標重復3次。并選取采摘當天的哈密瓜(貯藏第0 d為原始點為YSD)、低溫貯藏冷害癥狀明顯的第42 d果實為對照組(C)和草酸處理的樣品組(T)為轉錄組測序的試驗材料。每個樣品均由9個獨立的哈密瓜果皮組織混合構成。高通量測序實驗使用3個生物學重復。生理指標和轉錄組測序的樣品均在果實的赤道區域周圍取約2 mm厚的果皮組織,混勻后用液氮冷凍并在-80 ℃冰箱中放置。

1.2.2 細胞膜滲透率和丙二醛(MDA)含量的測定

1.2.2.1 細胞膜滲透率 采用電導率儀測定,參照Wang等[30]的方法。分別在哈密瓜的前中后3個部位取果皮后用打孔器取出直徑1 cm,切成厚度為5 mm的圓片,每個部位取4片,每個處理3個果實,3個重復,結果以%表示。

1.2.2.2 MDA的含量測定 參照Chen等[31]的方法,取1.0 g哈密瓜果皮組織,加入5.0 mL 100 g/L三氯乙酸(TCA)溶液,研磨勻漿后于12000×g離心20 min,取上清液2.0 mL 與0.67%硫代巴比妥酸(TBA)混合煮沸20 min,分別測定450、532和600 nm波長的吸光度值。MDA含量表示為nmol·g-1FW。

1.2.3 轉錄組測序

1.2.3.1 總RNA提取及質量檢測 總RNA提取按照Tiangen RNAprep試劑盒說明書的描述進行提取。RNA純度采用NanoPhotometer? spectrophotometer(IMPLEN,CA,USA)檢測。RNA完整性用RNA Nano 6000 Assay Kit在Agilent Bioanalyzer 2100 system生物芯片分析系統(Agilent Technologies,CA,USA)中檢測。具體參照文獻[22]進行。

1.2.3.2 cDNA文庫構建及其質量檢測 使用Qubit? 2.0 Fluorometer(Life Technologies Corporation,美國)進行初步定量,稀釋文庫至1.5 ng·μL-1;然后使用Agilent 2100 Bioanalyzer對文庫的插入片段大小(Insert size)進行檢測;符合預期后,使用qRT-PCR方法對文庫的有效濃度進行準確定量(文庫有效濃度> 2 nmol/L),以保證文庫質量。qRT-PCR采用QuantStudio 12K儀器進行操作,由三個步驟組成:(1)反轉錄:依賴反轉錄酶將RNA反轉錄成cDNA;(2)擴增:用PCR的方法擴增cDNA;(3)檢測:實時檢測和定量擴增的產物.

總RNA樣品檢測合格后,用帶有Olog(dT)的磁珠富集mRNA;其測序文庫構建使用NEB建庫試劑盒(產自美國),使用Agencourt? AMPure XP磁珠純化PCR產物并得到最終產物。具體參照文獻[22]進行。

1.2.3.3 測序工作 轉錄組測序工作委托諾禾致源公司完成。

1.2.3.4 生物信息分析 (1)高通量測序得到的原始圖像數據文件經CASAVA堿基識別(Base Calling)分析轉化為原始測序數據(Raw Reads),結果以FASTQ(簡稱為fq)文件格式存儲。

(2)測序數據質量評估:a. 錯誤率分布檢查;Illumina Hiseq? 2500的堿基質量值用Qphred=-10log10(e),其中e為錯誤率。b. 數據過濾;原始測序序列Raw reads,其含有帶接頭和低質量的Reads。為確保信息分析質量,需對Raw reads過濾,得到過濾后的測序數據(Clean reads),其后續分析均基于Clean reads。

Raw reads過濾條件:①去除帶接頭(Adapter)的Reads;②去除N(N為無法確定堿基信息)的比例大于10 %的Reads;③去除低質量Reads(質量值Qphred≤ 5的堿基數占整個read的50%以上的Reads)。

(3)轉錄本拼接采用Trinity軟件(v2012-10-05;其中min_kmer_cov為2,其它參數為默認模式),原理參照Grabherr等對clean reads進行拼接。

(4)基因功能注釋在本實驗中,基因功能注釋所用到的數據庫為:Nr(NCBI non-redundant protein sequences)是NCBI官方的蛋白序列數據庫;Nt(NCBI nucleotide sequences)是NCBI官方的核酸序列數據庫;Pfam(Protein family)蛋白數據庫;Swiss-Prot蛋白序列數據庫;KOG/COG(Clusters of Orthologous Groups of proteins)基因功能注釋數據庫;KO(KEGG Ortholog database)基因功能注釋數據庫和GO(Gene Ontology)基因功能注釋數據庫。參照文獻[22]進行。

1.3 數據分析

采用Excel進行處理試驗數據,用SPSS 20.0軟件進行方差和顯著性分析。LSD測試確定均值的差異,P<0.05為顯著性。用Origin 8.0 軟件進行作圖。

2 結果與分析

2.1 草酸對哈密瓜細胞膜滲透率和MDA含量的影響

冷藏0～7 d,草酸處理組和對照組的哈密瓜膜滲透率下降,但冷藏7 d后,兩組的膜滲透率逐漸上升,說明低溫冷藏加劇膜脂氧化。除第21 d外,草酸處理組哈密瓜的膜滲透率顯著低于對照組(P<0.05)(圖1A),表明草酸處理一定程度可降低膜滲透率的上升,但不能完全抑制。

圖1B顯示貯藏期間(0～28 d),對照組和草酸處理組哈密瓜MDA含量不升反而逐漸下降,分別在第28和35 d開始急劇上升,說明草酸處理可推遲MDA含量急劇上升的時間,冷藏至42 d時,對照組哈密瓜的MDA含量較草酸處理組高3倍,表明草酸處理極顯著抑制MDA含量的上升(P<0.01)。

圖1 草酸處理對哈密瓜細胞膜滲透率和MDA含量的影響Fig.1 Effect of OA treatment on relative electrolyte leakage and MDA content in Hami melon注:A為草酸處理對哈密瓜細胞膜滲透率的影響; B為草酸處理對哈密瓜MDA含量的影響。

2.2 哈密瓜冷害癥狀分析

由圖2可以看出,在3 ℃條件下,貯藏至第42 d,對照組C和草酸處理組T均出現比較嚴重的冷害癥狀,且C較T嚴重,褐色凹陷斑塊明顯增多。說明草酸處理組在一定程度上可以減輕冷害癥狀,但不能完全抑制。同樣YSD與C相比,也可以發現42 d的低溫冷藏導致果實出現低溫迫害,冷害癥狀出現。

圖2 采收當天(YSD)、冷藏42d的對照組(C)和草酸處理組(T)哈密瓜冷害癥狀圖Fig.2 Chilling injury in Hami melon fruit at harvest YSD and 42 days at cold storage control and OA treatment 注:A:采收當天(YSD);B:冷藏42 d的對照組; C:冷藏42 d的草酸處理組。

2.3 哈密瓜轉錄水平調控分析

2.3.1 哈密瓜RNA提取結果分析 從圖3可看出,所有樣本的RNA條帶清晰,說明本實驗提取的RNA符合轉錄組試驗的要求。

圖3 不同哈密瓜RNA電泳圖譜Fig.3 Total RNA of the flesh of Hami melon in agaroseael electrophoresis

2.3.2 轉錄組數據可靠性分析

2.3.2.1 轉錄組堿基序列分析 表1結果顯示,哈密瓜果皮測序后,共獲得435224080條原始序列片段,過濾后序列數為418943882條,過濾后Q20堿基比率為97.52%,堿基錯誤率為0.11%,GC值為42.78%。可見,測序可滿足后續數據組裝及處理的要求。

表1 哈密瓜果實測序產量統計Table 1 Output statistics of sequencing of Hami melon fruit

2.3.2.2 組裝重疊片段(Contig)和基因片段(Unigene)長度分布 使用Trinity軟件對過濾后的序列進行組裝,獲得了252169條contig片段,總長274752807 nt;獲得了153128條Unigene,總長245819499 nt,其中聚類的Unigene數目為75266條,單獨的Unigene數目為77862條(表2)。N50是衡量轉錄本拼接大小的重要指標之一,較平均長度和中值長度更為合理;N50>1500 bp即可認為所拼接轉錄本可代表該轉錄組的全長轉錄本[25]。本文中拼接出轉錄本的N50為2290 bp,且基因的N50為2592 bp(表2),因此所得轉錄本可作為哈密瓜果實的全長轉錄本。

表2 哈密瓜轉錄組組裝質量統計Table 2 Assembly quality statistics of Hami melon transcriptome

2.3.2.3 哈密瓜轉錄組的Unigene長度分布 由表3可知,本研究拼接出252169個轉錄本,含有153128個基因。組裝出的153128條基因中,200～500 bp的有34086條占總基因的22.26%;500～1 kbp的有41180條,占26.89%;1～2 kbp有36391條,占23.77%;大于2 kbp的為41471條,占27.08%。

表3 轉錄本拼接長度頻數分布Table 3 The frequency distribution of transcript length

2.4 轉錄組數據分析

2.4.1 哈密瓜轉錄組的Unigenes功能注釋及COG分類 由表4可以得出,在153128條基因中,94792條基因(61.90%)、122307條基因(79.87%)和81294條基因(53.08%)可以比對到Nr、Nt和Swiss-Prot數據庫。在KOG數據庫中有39873條(26.03%)基因可以用來預測功能。在Go數據庫中有81337條基因可以映照到不同的功能節點上。

表4 基因功能注釋成功率統計表Table 4 Function annotation of unigenes

2.4.2 Unigene在NR數據庫中的注釋分類結果 本文采用無參的方法進行轉錄組試驗。表5結果顯示,樣品注釋到NR數據庫的基因數目(94792條)與甜瓜已發表基因組序列匹配度最高,達56%;其次是黃瓜8.7%;大麥1.8%和葡萄1.4%,基因數目分別為53083條、8284條、1670條和1363條。

表5 注釋到NR數據庫的分類結果Table 5 Species classification in NR database

2.4.3 Unigene在KOG中的功能分類 表6顯示,轉錄組中有153128條(表2所示)基因與KOG數據庫中的基因有對應關系。根據功能可將基因分為26類,其中,基因數目較多的前三類分別是:翻譯后修飾,蛋白質周轉,分子伴侶為5275條,占11.97%;其次是一般功能預測基因數量為5167條,占11.73%;第三為翻譯、核糖體結構和生物發生的基因數量為3481條,占7.9%。未知的蛋白基因數量最少,僅為2條。

表6 Unigene在KOG中的功能分類及分布Table 6 Functional classification and distribution of unigene in KOG

2.4.4 Unigene在GO功能中的分類 GO(Gene Ontology)富集分析反映出在生物過程(BP)、細胞組分(CC)與分子功能(MF)富集的GO term上分布的差異基因數目情況。代謝過程、細胞和束縛分別是BP、CC和MF上顯著富集的GO terms。表明這些GO terms對哈密瓜采后耐冷性提高起著重要的作用,其中代謝過程的基因條目數比較多,在GO中明顯得到富集(表7)。

表7 GO功能的分類Table 7 GO classification of unigene

2.4.5 Unigene在代謝通路的分析 轉錄組測序得到的153128條基因(表2所示),其中有33346條基因比對到KEGG數據庫進行代謝通路注釋(圖4)。注釋到細胞過程(2059條),環境信息處理(1248條),遺傳信息處理(9482條),代謝(19546條),有機系統(1013條)五大代謝通路。其中代謝通路種的基因數目比較多,以碳水化合物代謝為代表。對這些基因功能的挖掘,將為采后哈密瓜對外界逆境的分子應答及草酸調控機制奠定基礎。

圖4 代謝通路Fig.4 Metabolic pathways

3 討論與結論

“西州蜜25號”哈密瓜屬于典型的呼吸躍變果實,通常采用低溫貯藏延長其市場供應。但是該品種哈密瓜對低溫比較敏感,長時間低溫貯藏通常會引發冷害,尤其是離開低溫到達常溫下,冷害癥狀更加明顯,繼而發生腐爛,嚴重影響貨架期銷售。因此本文采用草酸(OA)對哈密瓜采后進行處理,結果表明,草酸處理降低哈密瓜果皮中細胞膜滲透率和MDA含量,緩解采后冷害發生。

結合表面特征和生理學特性,本研究利用Illumina平臺對選擇的原料果皮進行轉錄分析。結果獲得過濾序列數為418943882條,使用軟件Trinity對過濾序列進行組裝,獲得了153128條unigenes,總長245819499 nt。unigene的N50為2592 bp(表2),所得轉錄本可作為哈密瓜果實的全長轉錄本。共有71.28%的unigenes比對到NR數據庫中。注釋到NR數據庫中的unigenes有56%匹配到已發表甜瓜基因組序列(表5)。有部分unigenes尚未比對到NR、NT和Swiss-Pro數據庫,可能是哈密瓜低溫脅迫或草酸調控過程中新發現的轉錄本,尚需做進一步驗證。

在GO功能分類中代謝過程的基因條目數比較多,得到顯著富集(表7)。表明哈密瓜在低溫脅迫和被草酸調控的過程中,代謝過程占主導地位。為系統分析基因產物在細胞中的代謝途徑,以及這些基因產物的功能,將本次轉錄組測序得到的153128個unigenes比對到KEGG數據庫進行Pathway注釋。結果發現,有33346個(21.8%)成功獲得注釋,主要映射到五種不同的通路上,其中代謝通路中的基因數目較多,且以碳水化合物代謝為主(圖4)。更進一步說明在此次轉錄組測序中代謝過程的重要性。與單春會等對青霉菌侵染前后哈密瓜轉錄組構建和分析結果有所不同[29]。

研究表明,果蔬采后與低溫逆境脅迫相關的代謝通路常見有:活性氧代謝[3]、細胞膜脂氧化代謝[26-27]、滲透調節物質脯氨酸代謝[16]、磷脂代謝[28]和糖類代謝[21]等,且目前草酸處理調控低溫敏感性果蔬冷害的研究也主要涉及這幾方面[16,20-21]。根據本研究的初步分析,預測低溫冷藏的哈密瓜和草酸調控其冷害的代謝過程,與活性氧、細胞膜脂、脯氨酸與精氨酸及糖類代謝有關。因為一些與活性氧代謝相關的酶如POD、APX和GR等基因的表達水平上調[32];并在后續的研究結果中發現:與細胞膜脂代謝有關的LOX和PLD在低溫誘導及草酸調控過程中基因表達水平也呈現顯著性變化;且脯氨酸與精氨酸代謝在不同處理組之間被GO顯著富集情況也不同,冷藏42 d的草酸處理與對照富集系數Q-value為2.73-17,在貯藏0 d與冷藏42 d的對照果實中富集系數(Q-value)為0.058;在KEGG富集中糖類代謝在不同處理組之間表現不同,蔗糖磷酸合成酶、蔗糖合成酶基因及葡萄糖苷酶基因和在冷藏42 d的草酸處理與對照中呈顯著正調控,表明草酸處理誘導糖類代謝發生變化,從而降低冷害(正在撰寫)。與圖4中的碳水化合物代謝占主導相吻合。接下來將對三組樣品在GO和KEGG中富集的角度出發,分析研究哈密瓜采后抗冷及草酸調控的誘導機理。有望為采后哈密瓜相關耐冷性基因的表達調控奠定相關基礎,為哈密瓜采后對低溫耐受性的非生物保鮮技術提供理論依據。