黑木耳多糖的磷酸化修飾及其抗氧化活性研究

鄭常領,趙柄舒,王玉華,于寒松,張永生,劉俊梅,*

(1.吉林農業大學食品科學與工程學院,吉林長春 130118; 2.吉林華鑫菌業有限責任公司,吉林舒蘭 132600)

黑木耳(Auriculariaauricula)是我國珍貴的食用菌之一[1],東北地區資源豐富,其含有豐富的蛋白質、脂肪、維生素和微量元素等[2],并且還擁有極為豐富的多糖成分[3]。隨著近年來研究的深入,已發現木耳多糖具有抗氧化[4-5],抗癌[6],抗凝血[7]以及降低膽固醇[8]等多種功能活性。作為一種天然活性物質,黑木耳多糖成了食品、醫藥等領域的研究熱點。

多糖的生物活性取決于聚合物的分子性質,如單糖的分子量,鏈的構象,支鏈聚合的程度和糖苷鍵的類型等[9],研究發現,合理的多糖化學修飾有利于提高多糖的生物活性,如抗氧化[10],抗衰老[11],抗病毒[12]等。多糖的化學修飾方法主要包括磷酸化、乙酰化、硫酸化等[13],其中磷酸化修飾是多糖支鏈結構中羥基被游離的磷酸根基團所取代的過程[10]。近年來,不少科研人員已經發現磷酸化修飾后的多糖抗氧化活性顯著提高,如Yuan等[14]的研究表明,磷酸化修飾顯著提高了卡拉膠低聚糖清除DPPH自由基及羥基自由基的能力,表明多糖的抗氧化活性經磷酸化修飾后被提高;南征[15]發現磷酸化修飾顯著增強了杏鮑菇多糖超氧陰離子及羥基自由基的清除能力;Li等[16]報道了采用不同的化學修飾對芍藥多糖的抗氧化活性的影響,結果顯示,在羥基自由基清除能力上磷酸化表現出較其他修飾方法更高的清除率,同時也證明了磷酸化修飾能提高多糖的抗氧化活性。雖然磷酸化修飾在理論上可以提高多糖的抗氧化活性,但目前還沒有針對磷酸化黑木耳多糖的抗氧化活性研究的報道。因此,本研究對黑木耳胞外多糖進行磷酸化修飾,并且通過測定其對DPPH自由基、羥基自由基以及超氧陰離子自由基的清除能力來評價磷酸化黑木耳多糖的抗氧化活性,以期為黑木耳多糖的深加工和新型功能性食品的開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑木耳菌種(HX01) 由吉林華鑫菌業有限責任公司提供;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)、水楊酸、鄰苯三酚 美國Sigma公司;磷酸二氫鉀(KH2PO4)、三聚磷酸鈉(sodium tripolyphosphate,STPP)、三偏磷酸鈉(sodium trimetaphosphate,STMP)、濃硫酸、濃硝酸、Tris、鉬酸銨、無水乙醇 以上試劑均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司;液體發酵培養基 葡萄糖20 g/L,馬鈴薯浸提液200 g/L,KH2PO42 g/L,MgSO40.5 g/L,VB10.05 g/L,滅菌后備用。

FDU-7006型真空冷凍干燥機 韓國Operon公司;IR-Prestige-21型FTIR光譜儀 日本Shimadzu公司;UV-1700型酶標儀 日本Shimadzu公司;DDS-11A型臺式電導率儀 上海貝威科技有限公司;AVY220型分析天平 Mettler Toledo公司;HH:SY11-Ni型恒溫水浴箱 北京長豐儀器儀表有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 黑木耳多糖的制備 參照劉俊梅等[17]的方法,略作修改。無菌條件下,取直徑約1 cm2的保存于斜面的種子菌絲塊,接種于裝有100 mL液體發酵培養基的250 mL錐形瓶中,28 ℃,150 r/min的條件下揺瓶發酵5 d,得到液體種子。將液體種子按10%的接種量接種于裝有100 mL液體發酵培養基的250 mL錐形瓶中,于28 ℃,150 r/min 的條件下液態深層發酵5 d,得到液態深層發酵液。液態深層發酵液于5000 r/min離心10 min后收集上清液。上清液濃縮至原體積的1/5倍后,以三倍濃縮液體積的95%乙醇沉淀24 h,之后經真空冷凍干燥得到黑木耳多糖粗品。將粗多糖在60 ℃水浴中復溶,通過Sevage法除蛋白,H2O2脫色,然后利用透析袋透析除鹽處理后得到黑木耳多糖純品(AAP)。

1.2.2 黑木耳多糖的磷酸化 參照Ye等[18]的方法,略作修改。稱取磷酸化試劑7 g(STPP 5 g+STMP 2 g),溶解于蒸餾水中,定容至100 mL,配制為70 mg/mL的磷酸化試劑。定容后加入AAP 1 g,硫酸鈉5 g,溶解后調節pH至9.0,80 ℃條件下反應5 h。反應結束后,三倍體積的95%乙醇沉淀24 h。5000 r/min離心10 min去除乙醇,將沉淀樣品真空冷凍干燥。凍干樣品在60 ℃復溶,復溶樣液于截流分子量為8000～14000 Da的透析袋中透析[19],檢測樣液中的電導率,當電導率降至160 μS/cm時,結束透析。透析后,樣品濃縮至原體積的1/5倍,濃縮樣品經三倍體積的95%乙醇沉淀24 h,除去乙醇后凍干樣品即為磷酸化黑木耳多糖(P-AAP)。

1.2.3 磷酸根含量的測定 磷酸根含量的測定采用鉬藍比色法[20],以10 μg/mL的KH2PO4為磷酸根標準物。在試管中分別取0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5 mL磷酸根標準溶液,用去離子水定容至5 mL。依次添加1 mol/L的Tris 3 mL,20% VC水溶液1 mL,3 mol/L 硫酸溶液1 mL,3%的鉬酸銨溶液1 mL,之后在30 ℃的恒溫條件下反應30 min,測定樣品溶液于580 nm波長處的吸光度。繪制標準曲線。

磷酸化黑木耳多糖中磷酸根的測定:在燒杯中取0.5 g均勻的樣品,依次加入濃硫酸、濃硝酸各1 mL，并在通風櫥中加熱以產生白煙。冷卻至室溫,之后加入1 mL 30% H2O2,再次加熱,重復上述操作直至不產生白煙,以完全分解有機物。加入濃度為1 mL的6 mol/L HCl并加熱以分解酸。在進行測定時,取5 mL樣液通過標準曲線方法測定,并計算多糖中的磷酸根含量(以P計)。

1.2.4 黑木耳多糖磷酸化修飾的單因素實驗

1.2.4.1 磷酸化試劑(STPP與STMP質量比) 磷酸化試劑通常由STPP及STMP組成,濃度為70 mg/mL磷酸化試劑更利于磷酸化修飾多糖[21],本實驗選用STPP及STMP質量比分別為0∶7、1∶6、2∶5、3∶4、4∶3、5∶2、6∶1的磷酸化試劑,在反應溫度80 ℃,pH=8.0的條件下反應5 h后通過鉬藍比色法測定其磷酸根含量,研究不同STPP與STMP質量比的磷酸化試劑對P-AAP中磷酸根含量影響。

1.2.4.2 反應時間 選用STPP及STMP質量比為5∶2的磷酸化試劑,在80 ℃和pH=8.0的條件下,分別反應2、3、4、5、6 h,研究不同反應時間對P-AAP磷酸根含量的影響。

1.2.4.3 反應溫度 選用STPP及STMP質量比為5∶2的磷酸化試劑,分別在60、70、80、90、100 ℃,pH8的條件下反應5 h。研究不同的溫度對P-AAP中磷酸根含量的影響。

1.2.4.4 反應pH 選用STPP及STMP質量比為5∶2的磷酸化試劑,在反應溫度80 ℃,pH分別為6、7、8、9、10的條件下反應5 h,探究不同反應pH對P-AAP中磷酸根含量的影響。

1.2.5 響應面法優化磷酸化條件 在單因素實驗確定各因素取值范圍的基礎上,利用Box-Benhnken中心組合試驗設計原則。使用P-AAP中磷酸根的含量作為響應值,以磷酸化試劑中STPP質量(g),反應時間(h),反應溫度(℃),反應pH為獨立變量,設計四因素三水平響應面分析試驗,以確定磷酸化修飾的最優工藝條件,響應面試驗設計因素表見表1。

表1 響應面試驗因素與水平Table 1 Levels and factors of Box-Benhnken design

1.2.6 磷酸化黑木耳多糖的分離純化 多糖在進行抗氧化試驗之前有必要對其進行二次純化,以排除其他因素對抗氧化試驗結果的影響[22],因此本試驗對磷酸化多糖P-AAP先后通過DEAE-Sepharose Fast Flow柱以及Sephadex G-100柱進行分離純化,以提高磷酸化多糖抗氧化試驗結果的準確性。

1.2.6.1 DEAE-Sepharose Fast Flow凝膠柱分離純化 取磷酸化多糖P-AAP 5 mg,溶于5 mL蒸餾水中,加入到DEAE-Sepharose Fast Flow柱(1.6 cm×30 cm)中,以0、0.1、0.3、0.5、1 mg/mL的NaCl 溶液梯度洗脫,流速為1 mL/min。逐管收集洗脫液,每管收集5 mL,苯酚硫酸法檢測多糖含量,并繪制曲線。

收集到的不同多糖洗脫液組分,經濃縮,冷凍干燥后得到磷酸化多糖的各個組分。

1.2.6.2 葡聚糖凝膠G-100柱純化 取1.2.6.1中收集到的組分5 mg,溶于5 mL蒸餾水中,加入到Sephadex G-100柱(1.6 cm×30 cm)中,以蒸餾水進行洗脫,流速為0.5 mL/min,每管收集3 mL,苯酚硫酸法檢測多糖含量,并繪制曲線。收集到的多糖洗脫液,經濃縮,冷凍干燥后得到磷酸化多糖組分。

1.2.7 紅外光譜分析 使用FTIR光譜儀測定多糖的紅外光譜。純化后的P-AAP及AAP用光譜級KBr粉末以1∶200的比例研磨后壓片,在4000～400 cm-1的波數范圍內進行測量。

1.2.8 DPPH自由基清除能力試驗 參照You等[23]的方法,略作修改。在比色管中添加3 mL的5 mmol/L DPPH-乙醇溶液,不同濃度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL)的多糖樣液1 mL。搖勻后,在黑暗中靜置30 min。于517 nm處測定吸光值,記為A1;樣品溶液用1 mL無水乙醇代替,517 nm處吸光值分別記為A0;用3 mL蒸餾水代替DPPH-乙醇溶液,517 nm處吸光值分別記為A2。VC作為參照物。按照式(1)計算多糖對DPPH自由基的清除率。

式(1)

1.2.9 羥基自由基清除能力試驗 采用水楊酸法測定,參照Sun等[24]的方法,稍作修改。依次向比色管中加入9 mmol/L FeSO41 mL,9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液1 mL,不同濃度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL)的多糖樣液1 mL,加入8.8 mmol/L H2O21 mL后搖勻,在37 ℃下反應30 min,于510 nm處測定樣液的吸光值,記為A1。用1 mL蒸餾水代替樣液,記510 nm處吸光值為A0;用1 mL蒸餾水代替H2O2溶液,記517 nm處吸光值為A2。以VC為參照物。以公式(1)計算多糖對羥基自由基的清除率。

1.2.10 超氧陰離子自由基清除能力試驗 采用鄰苯三酚法[25]測定,在比色管中加入0.05 mol/L,pH7.4的Tris-HCl緩沖液3 mL,不同濃度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL)的多糖樣液1 mL,60 mmol/L鄰苯三酚溶液1 mL,快速混合,每隔30 s測定325 nm處吸光值,直至300 s,A0=A300 s-A30 s;以1 mL蒸餾水替代樣液,325 nm處吸光值,A1=A300 s-A30 s。以VC為參照物。按照式(2)計算多糖對超氧陰離子自由基的清除率。

式(2)

1.3 數據處理

本實驗所有實驗數據均重復測定三次,采用Origin 2017軟件作圖分析結果,利用Design Expert 8.0.6軟件設計響應面實驗并分析數據,采用SPSS 22軟件進行數據統計學分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 磷酸化試劑對黑木耳多糖中磷酸根含量的影響 以黑木耳胞外多糖中磷酸根含量作為磷酸化修飾程度的評價指標,磷酸根含量越高表示磷酸根基團接枝率越高,修飾程度也越高[26]。由表2可知,單獨使用STPP或STMP的磷酸化試劑后多糖的磷酸根含量均不及二者復合使用時磷酸根的含量,說明反應中二種試劑相互影響,使多糖中磷酸根含量發生變化。磷酸化試劑中STPP質量在1～5 g的范圍內時,隨著STPP質量的增加,磷酸根的含量呈上升趨勢,當磷酸化試劑中STPP質量達到5 g時,磷酸根含量達到最大值,為7.94%。隨后當磷酸化試劑中STPP質量為6 g時磷酸根含量呈下降趨勢,因為磷酸化試劑中STPP質量達到一定值后會導致黑木耳多糖結構的破壞[27],從而影響多糖中磷酸根的含量。因此,選擇磷酸化試劑中STPP質量為5 g進行響應面試驗。

表2 磷酸化試劑對黑木耳多糖中磷酸根含量的影響Table 2 Effect of phosphorylation reagents on the content of phosphate group in AAP

2.1.2 反應時間對黑木耳多糖中磷酸根含量的影響 由圖1可知,反應時間在2～5 h范圍內時,隨反應時間的延長,磷酸根的含量呈現上升趨勢,其中反應時間為5 h時,黑木耳多糖磷酸根含量達到最大值,為8.02%。但當時間達到6 h時,磷酸根的含量有所下降,這是由于高溫下長時間反應對多糖結構有所破壞,導致磷酸根含量降低[28]。因此,選擇反應時間為5 h進行響應面試驗。

圖1 反應時間對黑木耳多糖中磷酸根含量的影響Fig.1 Effect of reaction time on the content of phosphate group in AAP

2.1.3 反應溫度對黑木耳多糖中磷酸根含量的影響 從圖2可以看出,在溫度為60～100 ℃范圍內時,溫度升高,磷酸根含量增加,在90 ℃達到最大值，為8.19%。然而,當溫度進一步升高時,由于過高的溫度導致多糖結構的破壞,從而磷酸根含量降低[28]。因此,選擇反應溫度為90 ℃進行響應面試驗。

圖2 反應溫度對黑木耳多糖中磷酸根含量的影響Fig.2 Effect of reaction temperature on the content of phosphate group in AAP

2.1.4 反應pH對黑木耳多糖中磷酸根含量的影響 由圖3可知,堿性條件下對于磷酸根接枝于黑木耳多糖的結構上更加有利,因為糖苷鍵在酸性條件下容易水解,多糖降解嚴重[29-30]。pH在6.0～9.0時,磷酸根含量逐漸上升,其原因是因為堿性條件下更利于磷酸根的接支作用。當pH為9.0時,磷酸根含量達到最大值,為8.15%。但當pH繼續升高時,磷酸根含量呈現下降趨勢,這是由于過高的堿性環境會抑制磷酸化試劑的接枝作用所造成的[31]。因此,選擇反應pH為9.0進行響應面試驗。

圖3 反應pH對黑木耳多糖中磷酸根含量的影響Fig.3 Effect of pH on the content of phosphate group in AAP

2.2 響應面法優化黑木耳多糖磷酸化修飾條件的結果

2.2.1 響應面試驗設計及結果 在單因素優化試驗的基礎上,以磷酸化試劑中STPP的質量、反應時間、反應溫度以及反應pH為自變量,黑木耳多糖中磷酸根含量作為響應值,設計四因素三水平響應面分析試驗,試驗方案設計及結果見表3。

表3 磷酸化修飾參數響應面方案設計及結果Table 3 Optimization of response surface analysis and design of phosphorylated conditions

2.2.2 回歸模型方差分析 回歸模型方差以及顯著性分析的結果如表4所示。

表4 回歸模型的方差分析數據Table 4 Variance analysis data of regression model

Y=-304.00333+9.63583A+3.59982B+21.63317C+15.00583D-3.5×10-3AB+0.105AC-0.4275AD-0.04375BC-5.5×10-3BD+0.215CD-0.81925A2-0.018018B2-1.12175C2-1.40925D2

由表4可知,因素中一次項 B、C,二次項 A2、B2、C2、D2對磷酸根含量具有極顯著的影響,表明各因素與響應值之間不是簡單的線性關系,其中AD、BC對磷酸根含量影響顯著。

2.2.3 響應面分析與優化 各因素以及兩兩因素之間交互作用對響應值的影響情況可以直觀地從響應面圖形中反映出來[32]。如圖4、圖5顯示了黑木耳多糖磷酸根含量的3D響應面圖及等高線圖。

圖4 STPP質量及反應時間對磷酸根含量的影響Fig.4 Effect of STPP addition and reaction time on the content of phosphate group

圖5 反應pH及反應溫度對磷酸根含量的影響Fig.5 Effect of pH and reaction temperature on the content of phosphate group

由圖4～圖5可以看出,磷酸化試劑中STPP質量與反應時間以及溫度與pH之間有交互作用。且圖4～圖5中響應面圖形開口向下,有最大值,表明此模型可進行最優結果分析。通過軟件優化,以磷酸根含量為指標,得到磷酸化修飾黑木耳多糖的工藝參數為磷酸化試劑中STPP質量為4.93 g,反應溫度88.16 ℃,反應時間5.06 h,反應pH為8.64,磷酸根含量預期值為9.84%。考慮到實際條件,參數確定為磷酸化試劑中STPP質量為5 g,STMP質量2 g,反應溫度88 ℃,反應時間5 h,反應pH為8.6。在當前條件下,對AAP進行磷酸化修飾,測得磷酸根含量為(9.93%±0.21%,n=3),與預期值接近,說明該模型可應用于磷酸化修飾黑木耳多糖。

2.3 磷酸化多糖的分離純化結果

如圖6,磷酸化黑木耳多糖P-AAP經DEAE-Sepharose Fast Flow柱層析,分別于蒸餾水以及0.1 mol/L的NaCl兩個洗脫溶液處得到了2個洗脫峰。由于第二個峰不易收集,所以對第一個峰收集,之后經濃縮,真空冷凍干燥,命名為P-AAP1,進行下一步試驗。

圖6 磷酸化多糖P-AAP的DEAE-Sepharose Fast Flow洗脫曲線Fig.6 Chromatography of P-AAP on DEAE-Sepharose Fast Flow

如圖7,P-AAP1經Sephadex G-100柱純化后,在蒸餾水的洗脫下得到一個單一對稱峰,表明該多糖組分無其他雜質,P-AAP1磷酸化多糖組分經濃縮,真空冷凍干燥后進行下一步試驗。

圖7 磷酸化多糖P-AAP1的Sephadex G-100洗脫曲線Fig.7 Chromatography of P-AAP1 on Sephadex G-100

2.4 磷酸化黑木耳多糖的紅外光譜分析結果

AAP及P-AAP1在4000～400 cm-1波數范圍內的紅外光譜圖結果如圖8所示。

圖8 黑木耳多糖AAP及磷酸化黑木耳多糖P-AAP1的紅外光譜圖Fig.8 Infrared(IR)analysis of AAP and P-AAP1

該吸收峰為典型的多糖吸收峰并且磷酸化前后峰型未發生較大變化,說明多糖的主體結構沒有變化[33]。P-AAP1和AAP在3336 cm-1處的吸收峰為-OH的伸縮振動吸收峰,表明P-AAP1和AAP中含有分子內氫鍵[34];2931、1417 cm-1處為C-H的伸縮振動吸收峰,為糖類的特征吸收峰[35];其中1668 cm-1處的吸收峰是羰基C=O鍵的吸收峰;1021 cm-1處的吸收峰表明P-AAP1和AAP為吡喃糖[36]。除此之外,P-AAP1在1215 cm-1處的吸收峰為P=O鍵的伸縮振動吸收峰,903 cm-1處的吸收峰為P-O-C鍵的吸收峰[37],這兩個峰的變化表明有磷酸基團接入。綜上,磷酸化修飾黑木耳多糖成功,所得產物為磷酸化黑木耳多糖。

2.5 磷酸化黑木耳多糖的抗氧化活性分析結果

2.5.1 DPPH自由基清除能力分析 AAP及P-AAP1的DPPH自由基的清除率結果如圖9所示。

圖9 磷酸化黑木耳多糖的DPPH自由基的清除率Fig.9 Scavenging rate of DPPH radical by phosphated Auricularia auricular polysaccharides

由圖9可知,P-AAP1在一定濃度范圍內,濃度與清除率呈現量效關系,并且濃度越高,多糖對DPPH自由基的清除率越高。在濃度為5 mg/mL時,P-AAP1和AAP的清除率分別為87.97%、53.60%,P-AAP1較AAP的清除率提高了34.37個百分點,說明磷酸化修飾提高了黑木耳多糖清除DPPH自由基的能力。更低的半抑制濃度IC50值反應了更強的清除自由基能力[38],P-AAP1、AAP及VC的IC50值分別為1.07、3.14、0.19 mg/mL,P-AAP1的IC50值雖高于VC,但低于AAP,說明磷酸化修飾可以提高黑木耳多糖清除DPPH自由基的能力。Deng等[39]證明了大型真菌竹蓀中的多糖,經磷酸化修飾后提高了多糖對DPPH自由基的清除能力,并且同樣擁有劑量依賴性。

2.5.2 羥基自由基清除能力分析 AAP及P-AAP1的羥基自由基的清除率結果如圖10所示。

圖10 磷酸化黑木耳多糖的羥基自由基的清除率Fig.10 Scavenging rate of hydroxyl radical by phosphated Auricularia auricular polysaccharides

由圖10可知,P-AAP1和AAP對羥基自由基都有的清除作用,并且反映出清除率對多糖濃度具有依賴性。在濃度為5 mg/mL時,P-AAP1和AAP的清除率分別為86.63%、56.24%,P-AAP1較AAP的清除率提高了30.39個百分點,表明磷酸化修飾后對羥基自由基的清除作用有所提高。P-AAP1的IC50值為0.91 mg/mL,高于VC的IC50值0.42 mg/mL,但低于AAP的IC50值3.34 mg/mL,說明黑木耳多糖經磷酸化修飾后可以有效的提高其清除羥基自由基的能力。Guo等[40]對乳酸乳球菌的胞外多糖進行磷酸化修飾后證明了同樣的結論。

2.5.3 超氧陰離子自由基清除能力分析 AAP及P-AAP1的超氧陰離子自由基的清除率結果如圖11所示。

圖11 磷酸化黑木耳多糖的超氧陰離子自由基的清除率Fig.11 Scavenging rate of superoxide anion radical by phosphated Auricularia auricular polysaccharides

由圖11可知,P-AAP1對超氧陰離子自由基的清除能力在濃度的增加的同時呈現上升趨勢,在濃度為5 mg/mL時,P-AAP1和AAP的清除率分別為81.26%、54.86%,P-AAP1較AAP的清除率提高了26.40個百分點,表明磷酸化修飾后提高了黑木耳多糖對超氧陰離子自由基的清除率。P-AAP1、AAP和VC的IC50值分別為0.41、2.24、0.12 mg/mL,P-AAP1的IC50值雖高于VC的IC50值,但相對于AAP的IC50值明顯降低,表明磷酸化修飾可以提高黑木耳多糖清除超氧陰離子的能力,而且與其他兩種自由基清除能力相比,P-AAP1對超氧陰離子自由基的清除能力,表現的更突出。孫婕等[41]對南瓜多糖磷酸化修飾后也證明了同樣的結論,即磷酸化后的多糖具有對超氧陰離子更強的清除能力。

3 結論

通過單因素與響應面試驗優化后,得到磷酸化修飾黑木耳多糖的最優工藝參數,在最優工藝參數下多糖中磷酸根含量為9.93%,與模型預期值9.84%接近。紅外光譜試驗結果顯示磷酸化修飾前后多糖的主體結構未發生變化,并且多糖結構中有磷酸基團的出現,說明磷酸化修飾成功。抗氧化活性試驗結果表明,P-AAP1較AAP具有更強的抗氧化活性。其中P-AAP1在濃度為5 mg/mL時,對DPPH自由基的清除率為87.97%,IC50值為1.07 mg/mL;濃度為5 mg/mL時,對羥自由基的清除率為86.63%,IC50值為0.91 mg/mL;濃度為5 mg/mL時,對超氧陰離子自由基的清除率為81.26%,IC50值為0.41 mg/mL。本試驗中三種自由基清除率均提升,IC50值均降低,說明通過磷酸化修飾的方法能夠提高黑木耳多糖的抗氧化活性。

多糖的抗氧化活性是因其含有的羥基和糖蛋白復合物而產生的,黑木耳多糖經過磷酸化修飾后其分子結構發生了衍生,從而生物活性發生改變,進一步影響黑木耳多糖的抗氧化活性。也有學者認為多糖經化學修飾,化學基團取代多糖上的羥基后,結構發生變化,更多的羥基被暴露從而抗氧化活性增強。但目前磷酸化黑木耳多糖的抗氧化作用機理還不明確,仍需進一步探討研究。