丹參和藏丹參毛狀根MYB和bHLH轉錄因子基因表達差異研究

王艷婷，郭妍宏，王飛艷，方譽民，夏鵬國，梁宗鎖，楊東風

(浙江理工大學生命科學與醫藥學院，浙江省植物次生代謝調控重點實驗室，浙江 杭州 310018)

丹參是唇形科鼠尾草屬植物丹參(SalviamiltiorrhizaBunge)干燥根和根莖，具有保護心腦血管、抗腫瘤、抗氧化、抗炎、抗纖維化等作用[1-2]。藏丹參(SalviacastaneaDiels f.tomentosaStib)產于西藏林芝地區，當地醫師把它的根和根莖作為丹參的替代品使用[3]。二氫丹參酮Ⅰ(dihydrotanshinone Ⅰ)、隱丹參酮(cryptotanshinone)、丹參酮Ⅰ(tanshinone Ⅰ)和丹參酮ⅡA(tanshinone ⅡA)等丹參酮和迷迭香酸(rosmarinic acid)、咖啡酸(caffeic acid)和丹酚酸B(salvianolicacid B)等酚酸是丹參的活性成分[4]。萜類化合物是植物次生代謝物質中最大的一個家族，其生物合成途徑包括發生在胞質的甲羥戊酸途徑(MVA)和發生在質體的赤蘚糖磷酸途徑(MEP)[5]。酚酸生物合成與苯丙烷途徑和酪氨酸途徑有關。藏丹參和丹參活性成分相似，但含量差異較大。丹參的丹酚酸B含量更高，藏丹參丹參酮ⅡA和迷迭香酸的含量更高[6]，然而兩種丹參活性物質積累差異的形成機制尚不明確。

轉錄因子可以整合內部(通常是發育)和外部(環境)信號來調節酶基因表達，從而控制次級代謝物的特定積累[7]。MYB和bHLH轉錄因子廣泛參與苯丙烷類代謝途徑和萜類代謝途徑的調控，歐芹、玉米、金魚草、擬南芥、苦蕎麥和矮牽牛中黃酮類的合成均受MYB轉錄因子的調控[7-9]，MYB轉錄因子也參與調控了丹參、擬南芥、火炬松中萜類化合物的合成[10-12]；金魚草、龍膽中黃酮類的合成均受bHLH轉錄因子的調控[13-14]；bHLH轉錄因子調控紅豆杉和丹參中萜類成分，長春花和黃連中生物堿類成分的積累，也已有報道[15-19]。本文通過比較紫花丹參和藏丹參毛狀根中MYB和bHLH基因表達的差異，分析可能參與調控丹參酮和丹酚酸的轉錄因子基因，以期揭示藏丹參和紫花丹參次生代謝的差異機制，為丹參酮和丹酚酸的合成及其調控奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料：發根農桿菌ATCC15834侵染丹參和藏丹參無菌苗獲得丹參和藏丹參毛狀根(種質來源由浙江理工大學生命科學學院梁宗鎖教授鑒定)。

基因和蛋白序列：GenBank數據庫中搜索(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。

試劑：多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)，反轉錄試劑盒 PrimeScriptTMRT reagent Kit和熒光定量PCR試劑盒SYBR Premix ExTaqTMⅡ(TaKaRa公司)，熒光定量PCR引物由杭州擎科梓熙生物技術有限公司合成。

儀器：熒光定量PCR儀(QuantStudio 6 Flex，ABI)。

1.2 蛋白序列系統進化分析

采用MEGA7.0中的NJ(Neighbor-joining)法構建系統發育進化樹，參數選擇Bootstrap為1 000。

1.3 實驗方法

1.3.1 丹參毛狀根培養

配制MS液體培養基，調pH值至5.8；0.2 g新鮮的毛狀根被轉至培養基中，在恒溫搖床中暗培養(25 ℃、110 r·min-1)24 d后采樣。

1.3.2 基因表達分析

參照多糖多酚植物總RNA提取試劑盒說明書提取總RNA后進行反轉錄(PrimeScriptTMRT reagent Kit)。采用SYBR Premix ExTaqTMⅡ進行熒光定量PCR反應，引物序列見表1，SmActin基因用作內參。反應條件為：95 ℃、30 s；95 ℃、5 s，58 ℃、30 s，40個循環。基因表達分析用比較CT法(2-ΔΔCT)。

表1 實時熒光定量PCR引物

表1(續)

1.3.3 數據分析

使用GraphPad Prism7作圖，數據以平均值±標準差表示，3個生物學重復。

2 結果與討論

2.1 藏丹參和丹參毛狀根中MYB表達差異

MYB轉錄因子不僅僅在植物細胞形態及模式建成、生長發育、逆境脅迫的應答中發揮重要的作用，在生理活動代謝、初生和次生代謝反應的調節也扮演者重要角色[20]。自從第一個MYB轉錄因子MYBC1(和細胞色素合成有關)在玉米中被鑒定[21]，各類MYB基因從各種植物中分離鑒定。截至2019年3月17日，NCBI(National Center for Biotechnology Information)中MYB基因已至59 586條。MYB是調節丹參酮和丹酚酸的調控因子。為了研究不同的轉錄因子在藏丹參和丹參的表達差異，對47個MYB轉錄因子基因進行了基因表達分析。結果表明，24個MYB(SmMYB60、SmMYB98、SmMYB87、SmMYB29等)在丹參中的表達顯著高于藏丹參，其中SmMYB60表達高達藏丹參的1 726.23倍，SmMYB98表達高達707.33倍(圖1中a)。SmMYB42、SmMYB34、SmMYB107、SmMYB85等4個MYB基因(圖1中c)在藏丹參中表達較高，分別高達丹參2.45、4.24、5.95、114.90倍。SmMYB96、SmMYB94、SmMYB80、SmMYB64等19個基因(圖1中b)表達在兩種丹參中表達差異不顯著。

SM，丹參；SC，藏丹參。圖3同。圖1 MYB基因的表達模式

Li等[11]首次對丹參中MYB轉錄因子做了系統的分析，他們報道了110個R2R3-MYB基因，并且預測第4、5和20亞組的SmMYB可能參與調控了萜類化合物生物合成[11]。SmMYB36轉錄因子基因是一個典型的R2R3轉錄因子，SmMYB36含有第四和第五亞族特有的DNEI結構，團隊前期克隆得到了SmMYB36轉錄因子基因，發現過表達SmMYB36促進了丹參酮的積累，但抑制了丹參中酚酸和類黃酮的生物合成[22]。序列分析SmMYB36和SmMYB34進化樹在同一分支(圖2)，實驗表明，SmMYB34在藏丹參中的表達量是丹參的4.43倍，SmMYB34可能與藏丹參對丹參酮的高積累有關。SmMYB39轉錄因子基因[23]和Li等[11]注釋的SmMYB76基因屬于同一條基因，為第4亞組[11]，研究表明，SmMYB76可以抑制丹酚酸的積累。在本研究中SmMYB76和SmMYB28在同一分支(圖2)，與前人研究一致[11]，本實驗中它在丹參中的表達量是藏丹參的8.18倍，這很可能與藏丹參低丹酚酸B積累有關。

●丹參中表達量較高；■藏丹參中表達量較高。圖4同。圖2 丹參MYB轉錄因子系統進化樹

丁慶倩等[24]從大豆中鑒定出一個在脅迫條件下明顯上調的MYB類轉錄因子SiMYB42。藏丹參(海拔2 900～3 500 m林芝地區)相對丹參(平原)面臨更多的高UV-B輻射等逆境壓力[25]。研究發現，酵母提取物和水解乳蛋白可以提高藏丹參和丹參中丹參酮的含量，并且藏丹參對酵母提取物的影響反應更大[26-27]。在玉米種MYB42與木質素含量的負調節有關[28]，木質素和酚酸生物合成都源于苯丙烷途徑。在本實驗中SmMYB42在藏丹參中的表達量是丹參的2.45倍，根據這些，推測SmMYB42在酚酸的積累過程發揮著重要的作用。

研究發現，過表達SmMYB98b毛狀根株系中丹參酮含量和丹參酮合成通路關鍵酶基因的表達都有所提高。干擾SmMYB98b毛狀根株系中丹參酮含量和丹參酮合成通路關鍵酶基因的表達都被抑制[29]。在本實驗中在丹參中的表達量高達藏丹參的707.33倍，SmMYB98可能酚酸的積累過程也扮演重要的角色。在草莓中FaMYB10正調節花青素的積累[30]，花青素等酮類的合成與酚酸的合成都依賴于PAL途徑，本實驗中SmMYB10在丹參中的表達量高達藏丹參的6.12倍，MYB10轉錄因子基因也可能是酚酸積累的一個重要調控因子。在蘋果中MYB22過表達株系花青素的積累和CHS、CHI、F3H等花青素通路關鍵酶基因的表達都被抑制，本實驗中SmMYB22在丹參中的表達量高達藏丹參的16.79倍，SmMYB22可能與藏丹參高迷迭香酸積累有關。

2.2 藏丹參和丹參毛狀根bHLH表達差異

bHLH轉錄因子家族是植物中最大的轉錄因子家族之一，參與調控了黃酮類化合物，生物堿和萜類化合物的生物合成。已發現10 907多個bHLH轉錄因子，已經完成系統性鑒定和分類的有擬南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(Oryzasativa)和煙草(NicotianatabacumL.)等[31-33]。為了研究不同的轉錄因子在藏丹參和丹參的表達差異，對47個bHLH轉錄因子進行了分析。結果表明，15個SmbHLH(SmbHLH69、SmbHLH33、SmbHLH123、SmbHLH96等)在丹參中的表達量顯著高于藏丹參，其中SmbHLH69表達高達藏丹參的1 727.61倍，SmbHLH33高達29.72倍(圖3中b)。SmbHLH48、SmbHLH46、SmbHLH79、SmbHLH108、SmbHLH73和SmbHLH77等6個bHLH基因(圖3中c)在藏丹參中表達量較高，分別高達丹參中表達量的2.51、3.36、8.95、12.36、34.02和124.67倍。SmbHLH121、SmbHLH10、SmbHLH29、SmbHLH26等26個基因(圖3中a)在兩種丹參中表達量差異不顯著。

圖3 bHLH 基因的表達模式

Zhang等[34]從丹參基因組中篩選出127個bHLH轉錄因子并進行了系統的分析。他們預測7個可能調節丹參酮生物合成的基因，分別為SmbHLH37(亞族R)、SmbHLH51(亞族R)、SmbHLH53(亞族R)、SmbHLH60(亞族W)、SmbHLH74(亞族H)、SmbHLH92(亞族P)和SmbHLH103(亞族P)。丹參SmbHLH10轉錄因子基因，它和SmbHLH83基因屬于同一條基因[35-36]，前期研究表明，SmbHLH83可以促進丹參酮的的積累[23]，在本研究的進化樹中單獨一個分支(圖4)，但它在藏丹參和丹參中表達量差異不顯著，推測SmbHLH83可能不是藏丹參和丹參次生代謝產物積累差異的主要原因。前人的研究表明，SmbHLH48和SmbHLH74同屬亞族H[34]，bHLH48和SmbHLH74序列相似，并且bHLH48在藏丹參中的表達量是丹參的2.51倍，bHLH48可能和藏丹參高丹參酮積累有關。

擬南芥MYC2[35]調節倍半萜合酶基因表達，并且丹參酮和倍半萜烯都是萜類化合物[35]。構建鄰接系統發育樹時發現bHLH51[34]和NtMYC2a，NtMYC2b和CrMYC2在相同的亞家族，并且SmbHLH51在根中表達水平比在其他3個器官的表達水平高，在用茉莉酸處理后呈上調的趨勢。SmbHLH51在丹參中的表達量是藏丹參的2.78倍，SmbHLH51在丹參酮生物合成中具有一定的調節作用。梨的紅色是花青素積累的結果，SmbHLH33參與花色素苷生物合成的差異調節[36]，定量結果顯示SmbHLH33在丹參中的表達量高達藏丹參的29.72倍，苯丙烷代謝也是黃酮類化合物(例如花青素、黃酮、黃酮醇及其糖苷)的上游途徑，花青素都與酚酸生物合成共享相同的前體[37]，SmbHLH33可能參與迷迭香酸和丹酚酸B的生物合成。擬南芥中miR393靶向轉錄因子bHLH77和生長素受體TIR1，AFB(1，2，3)[38]，生長素在植物的生長發育中發揮著重要的作用，SmbHLH77在藏丹參中的表達量高達丹參的155.41倍，可能間接的調節丹參次生代謝物質的積累。AtbHLH122轉錄因子可以調控ABA的積累來參與植物適應逆境脅迫。有研究表明，施用適量的赤霉素能促進丹參的生長和丹參根中丹參酮類物質的積累。SmbHLH122在丹參中表達量僅僅是藏丹參的2.16倍，暗示轉錄因子可能不是藏丹參高丹參酮積累的關鍵轉錄因子[39]。

圖4 丹參bHLH轉錄因子系統進化樹

3 小結

本研究采用熒光定量PCR分析了MYB和bHLH轉錄因子在藏丹參與丹參毛狀根中的表達差異，結果表明：有24個MYB(SmMYB60、SmMYB98、SmMYB87、SmMYB29等)和15個SmbHLH(SmbHLH69、SmbHLH33、SmbHLH123、SmbHLH96等)在丹參中高表達，有4個MYB(SmMYB96、SmMYB94、SmMYB80、SmMYB64)和6個SmbHLH(SmbHLH48、SmbHLH46、SmbHLH79、SmbHLH108、SmbHLH73和SmbHLH77)在藏丹參中高表達。這些差異表達的轉錄因子可能參與調控了丹參酮和丹酚酸的積累，導致藏丹參和丹參次生代謝的差異。但是這些轉錄因子是如何參與代謝目前還不太清楚，需要做進一步的研究。本研究為揭示丹參和藏丹參的差異以及丹酚酸、丹參酮的生物合成機制奠定了基礎。