調脾護心方對慢性心力衰竭大鼠toll樣受體4及TNF-α表達的影響

付 軍，祝德偉2，戴小華，楊 帆，王銀燕，戚先偉

慢性心力衰竭是多種心血管疾病最終的歸宿，是由高血壓、冠心病、心臟瓣膜病等各種原因引起心臟負荷過重、心肌收縮力下降，導致心排血量不足引起一系列臨床癥狀和體征的復雜綜合征。相關調查顯示：我國慢性心力衰竭病人發病率高達0.9%，且隨著年齡不斷增加，發病率逐年增高，嚴重威脅人類的健康和生活質量[1]。目前認為心室重構是慢性心力衰竭發生的基本機制，近年來隨著對慢性心力衰竭機制的不斷深入研究，炎性細胞因子在慢性心力衰竭發生發展中的作用引起學者關注。有研究發現，免疫系統介導在心力衰竭中起到重要的作用，可激發炎癥因子釋放炎癥因子，加速心肌肥大及纖維化，促進心肌細胞凋亡，引起心室重構，從而導致心力衰竭的發生和發展[2]。本研究觀察調脾護心方對慢性心力衰竭大鼠toll樣受體4和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)表達的影響及光鏡下大鼠心肌細胞的變化情況，探討中藥調脾護心方對慢性心力衰竭大鼠炎癥因子的影響及作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選擇體重250～300 g周齡配對的SD雄性健康大鼠40只，所有大鼠均購自安徽中醫藥大學動物實驗中心，隨機分為對照組、中藥高劑量組、中藥低劑量組、西藥組和模型組，各8只。

1.2 實驗藥品與試劑 調脾護心方(顆粒劑)，組方：茯苓、陳皮、炙甘草、廣木香、酸棗仁、炙遠志、白術、蒲公英等，為安徽省中醫院提供；培哚普利(施維雅制藥有限公司，批準文號：H20034053，規格：每片4 mg)；B型鈉尿肽(BNP)抗體(上海信裕生物工程有限公司)；toll樣受體4多克隆抗體(北京中杉生物技術有限公司)；大鼠toll樣受體4免疫法試劑盒(R&D system 公司)，大鼠TNF-α免疫法試劑盒(R&D system 公司)。

1.3 實驗設備 小動物呼吸機(北京拜安吉科技有限公司)，心電圖機(上海 XDH-3B)，多導生理儀(Power Lab數據采集分析系統，澳大利亞 ADInstruments 生產)。

1.4 實驗方法

1.4.1 造模方法 左冠狀動脈前降支結扎法：40只SD雄性健康大鼠術前禁食8 h，之后采用10%水合氯醛(0.4 mL/100 g)麻醉，將大鼠頭部及四肢固定于手術臺上，并用牙線固定牙齒，待大鼠呼吸平穩后，行氣管插管連接小動物呼吸機，調整通氣量(成功標準為吸呼比1∶2，呼吸頻率90次/min，潮氣量14 mL/kg)，標記大鼠正常心電圖。完成后，充分暴露大鼠左前胸，常規剃毛、消毒后，沿胸骨左側第3、4肋間打開大鼠胸腔，暴露大鼠心臟，之后使用無菌齒鑷輕提左心耳，暴露大鼠心臟主動脈根部，帶線縫合針繞過冠狀動脈(心上緣)結扎心肌組織2～3 mm，打兩個死結，以縫線下心肌顏色變淺變白，同時結扎成功標準為心電圖提示模型大鼠Ⅱ導聯ST段明顯抬高(≥0.1 mV)[3]。縫合胸壁后，術后皮下注射青霉素8×105U，呋塞米20 mg，鹽酸利多卡因0.1 g預防感染及利尿，待大鼠恢復自主呼吸后撤離呼吸機。將術后存活大鼠常規喂食及水4周。第28天用10%水合氯醛(0.4 mL/100 g)麻醉后備皮，采用多導生理儀系統測量各組大鼠左室舒張末壓(LVEDP)，具體操作：大鼠消毒備皮后，頭部及四肢固定于手術臺上，分離右頸總動脈，將多導生理記錄儀一端插入右頸總動脈，之后進一步接入左心室，另一端接入壓力換能器，之后同步記錄心電圖、LVEDP。造模成功標準為[4]LVEDP>15 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)。

1.4.2 給藥方法 中藥高劑量組以23.40 mg/(kg·d)標準給予調脾護心方顆粒劑灌胃，中藥低劑量組以5.85 mg/(kg·d)標準給予調脾護心方顆粒劑灌胃，西藥組以0.36 mg/(kg·d)標準給予培哚普利灌胃，模型組和對照組給予相同劑量生理鹽水灌胃。各組均給予相應藥物灌胃4周。

1.5 標本采集及檢測方法

1.5.1 心電圖 采用動物心電圖機(型號為XD7100)于造模前后檢測并記錄所有大鼠心電圖。

1.5.2 酶聯免疫吸附實驗(ELISA)檢測BNP、TNF-α 灌胃前于大鼠眼眶后采集血液5 mL，加入抗凝管，以3 000 r/min離心5 min，通過實驗室自動生化分析方法進行檢測。

1.5.3 toll樣受體4蛋白檢測 灌胃4周后，打開胸腔，取心室肌組織，將取出的心肌組織在抽提液中溶解，之后離心后收集上清液；將載有蛋白的聚偏二氟乙烯膜(PVDF)通過轉膜方法放入到緩沖液中；取出PVDF后，放入到稀釋1∶1 000的一抗中，之后靜置整晚后，再洗膜3次，頻率為每10 min洗膜1次；稀釋辣根過氧化酶(HRP)標記的二抗(羊抗鼠IgG)到工作濃度(1∶1000)，之后將膜置于二抗中，37%搖床孵育1 h；每10 min 1次，洗膜次數共5次。以β-actin為內參，檢測toll樣受體4蛋白表達。

1.5.4 免疫組化檢測TNF-α表達 取出水合氯醛麻醉后的心室心肌組織，采用4%多聚甲醛固定，時間24 h，脫水、石蠟包埋，以磷酸鹽緩沖溶液(PBS)沖洗切片脫蠟的心室心肌組織，采用檸檬酸高壓方式修復2min；PBS沖洗，經過整晚時間后在TNF-α一抗(1︰200)基礎上，加二抗以37 ℃溫度孵育2 h，心室心肌組織通過蘇木素再次染色10 s后，光學顯微鏡下觀察、拍照，之后通過Motic Med 6.0數碼醫學圖像分析心室肌組織TNF-α表達。

1.5.5 心肌病理學觀察 灌胃結束后，采用10%水合氯醛(0.4 mL/100 g)麻醉，取出心室心肌組織，之后沿左心室長軸橫斷面取厚度合適的數張切片(間隔為 1 mm)，厚度約4 μm，通過4%多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋，所有標本HE染色。

2 結 果

2.1 各組大鼠一般情況 手術過程或術后感染共4只大鼠死亡，其中中藥低劑量組1只，西藥組1只，模型組2只。除對照組外，其他各組大鼠均出現不等程度倦臥、脫毛、精神萎靡、納食減少、消瘦等癥狀；經藥物治療后，大鼠上述癥狀均有不同程度改善，其中中藥高劑量組改善更顯著；與模型組比較，中藥低劑量組與西藥組大鼠上述狀態有所改善。

2.2 大鼠心電圖比較 模型大鼠Ⅱ導聯ST段明顯抬高(≥0.1 mV)，提示急性心肌梗死大鼠造模成功。詳見圖1、圖2。

圖1 造模前心電圖

圖2 造模后心電圖

2.3 各組大鼠心功能比較 與對照組比較，模型組和各給藥組大鼠LVEDP均>15 mmHg，且差異有統計意義(P<0.05)，提示慢性心力衰竭模型造模成功。與對照組比較，模型組和各給藥組大鼠BNP明顯偏高，差異有統計學意義(P<0.05)，說明通過結扎左冠狀動脈前降支可建立慢性心力衰竭大鼠模型。詳見表1。

組別只數LVEDP(mmHg)BNP(ng/mL)對照組 8 8.69±1.13123.58±15.41 模型組 6 17.83±1.651)730.13±23.151)西藥組 7 18.57±2.451) 702.29±63.131)中藥低劑量組 7 17.92±1.591) 649.13±27.831)中藥高劑量組 8 16.07±0.951) 670.85±36.301)

與對照組比較，1)P<0.05

2.4 各組大鼠toll樣受體4水平比較 模型組大鼠心肌toll樣受體4蛋白表達明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，中藥低劑量組、中藥高劑量組、西藥組心肌toll樣受體4蛋白表達顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)；中藥低劑量組與西藥組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。詳見表2、圖3。

組別 只數toll樣受體4對照組 80.28±0.07模型組 61.31±0.071)西藥組 7 0.56±0.052)中藥低劑量組 7 0.81±0.082)3)中藥高劑量組 8 0.58±0.062)

與對照組比較，1)P<0.05；與模型組比較，2)P<0.05；與西藥組比較，3)P<0.05

1為對照組；2為模型組；3為中藥低劑量組；4為中藥高劑量組；5為西藥組

圖3各組toll樣受體4蛋白相對表達量比較

2.5 各組大鼠心肌組織TNF-α水平比較 免疫組化染色后，模型組心肌細胞胞漿內可見TNF-α蛋白陽性表達，呈棕黃色，各治療組心肌細胞胞漿內TNF-α蛋白表達減少，尤以中藥高劑量組、西藥組心肌細胞胞漿內明顯，詳見圖4。模型組大鼠心肌TNF-α表達明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，中藥低劑量組、中藥高劑量組、西藥組心肌TNF-α表達顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)；中藥低劑量組與西藥組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。詳見表3。

圖4 各組大鼠心肌細胞胞漿內TNF-α表達情況

組別 只數 TNF-α 對照組867.96±9.01模型組 6286.49±28.791)西藥組7138.73±18.012)中藥低劑量組 7216.72±13.452)3)中藥高劑量組 8141.73±17.702)

與對照組比較，1)P<0.01；與模型組比較，2)P<0.05；與西藥組比較，3)P<0.05

2.6 各組大鼠心肌細胞病理圖像 對照組大鼠心肌細胞形態正常，心肌纖維未見增粗，未見水腫、壞死；模型組心肌纖維粗大、水腫及壞死、心肌細胞排列紊亂；中藥高劑量組與西藥組心肌細胞改善情況比較，無顯著差異；中藥低劑量組心肌纖維改善明顯，心肌細胞排列緊密。詳見圖5。

圖5 各組大鼠心肌細胞病理圖像

3 討 論

相關研究表明，各種炎性因子激活與慢性心力衰竭密切相關，它們在心力衰竭的發生發展中發揮重要作用[5]。toll樣受體4蛋白是近年來發現的與心血管疾病相關的天然免疫受體，主要由內質網分泌和產生，在人體內多種細胞中廣泛表達，介導天然免疫的跨膜信號傳遞受體[6]，toll樣受體4可調節心肌細胞炎癥狀態，參與心肌炎、心肌梗死后、心力衰竭等心血管疾病發生[7]。有研究表明，包括冠心病在內的缺血性心臟病均存在toll樣受體4分子表達上調，而這種增高與疾病嚴重程度及炎性介質TNF-α、白介素6(IL-6)相關[8]，且心功能越差者，toll樣受體4表達越高[9]。toll樣受體4可激活心肌細胞內的核因子-κB，可使核因子-κB由細胞質轉移至細胞核，從而引起IL-6、TNF-α等炎癥因子表達升高。炎性物質浸潤，使心肌實質減少，纖維組織增多，從而導致心室重構及心力衰竭的形成[10]。

TNF-α主要由激活的巨噬細胞生成，目前越來越多研究發現TNF-α是慢性心力衰竭發生、發展中重要的影響因素，可反映慢性心力衰竭的嚴重程度。TNF-α對心肌具有負性肌力作用，可加速心肌細胞凋亡，促進心室重塑，且TNF-α水平越高，慢性心力衰竭嚴重程度和病人病死率越高[11]。TNF-α通過抑制肌漿網Ca2+泵，參與左心室重塑和心肌纖維化過程從而使其功能喪失[12]；通過激活多個細胞凋亡途徑，誘導心室重塑，促發心肌細胞凋亡，介導慢性心力衰竭的發生[13]；刺激誘導型一氧化氮合酶生成一氧化氮，損傷心肌細胞，抑制心肌收縮力，從而導致心力衰竭[14]。

調脾護心方由戴小華主任根據歸脾湯及酸棗仁湯化裁而成，主要由茯苓、陳皮、白術、炙甘草、廣木香、酸棗仁、炙遠志、蒲公英等藥物組成，具有健脾益氣、養心安神之功效。臨床治療慢性心力衰竭過程中，發現其能減輕臨床癥狀，改善病人心功能及預后[15]。前期實驗研究發現，調脾護心方可明顯降低血清肌酸激酶(CK)和乳酸脫氫酶(LDH)活性，并可相應降低BNP、心肌肌鈣蛋白I(cTnI)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、C反應蛋白(CRP)等[16]。本研究結果顯示，調脾護心方能改善大鼠慢性心力衰竭心功能，減輕臨床癥狀，其機制與抑制慢性心力衰竭炎癥狀態有關，抗炎作用與培哚普利相當，同時為調脾護心法改善慢性心力衰竭炎癥狀態提供有力的實驗依據。