天麻鉤藤飲對自發性高血壓大鼠外周血VEGF、TNF-α及EPCs動員的影響

周 巍，趙英強，莊建國2，李 甜，王 娟

流行病學研究顯示，預計到2025年全球高血壓病人將增加到15.6億人[1]。2010年我國高血壓防治指南指出，目前有約2億高血壓病人，且高血壓病人總體知曉率、治療率和控制率明顯較低，分別低于50%、40%和10%[2]，同時高血壓具有高患病率、高死亡率、高致殘率的特點，已成為公共衛生事業面臨的一項巨大挑戰。

高血壓的發生發展與血管內皮結構和功能紊亂密切相關，為目前臨床研究熱點之一。天麻鉤藤飲是治療肝陽上亢型高血壓疾病的經典方劑，具有平肝熄風、清熱活血、補益肝腎的作用。前期研究發現，天麻鉤藤飲能改善自發性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rat，SHR)的小血管舒縮功能，但對內皮功能影響的機制研究較少。本研究探討不同劑量天麻鉤藤飲及依那普利對SHR血壓、內皮損傷修復及內皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)動員的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級12周齡健康雄性SHR 50只，同源、同周齡、同性別且血壓正常的京都維斯特大鼠(Wistar-kyoto rats，WKY)6只，體重(250±30)g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK(京)2016-0011。所有動物均飼養于中國醫學科學院放射醫學研究所清潔級動物房，每籠5只(注：WKY為1籠)，分籠喂養。飼養于室內通風櫥內，恒溫(24±2)℃，濕度50%～70%，自然晝夜，自由取食及飲水。

1.2 實驗藥物 天麻鉤藤飲湯劑，組方：天麻10 g，鉤藤15 g(后下)，石決明20 g(先煎)，山梔6 g，黃芩6 g，川牛膝12 g，杜仲12 g，益母草12 g，桑寄生12 g，夜交藤12 g，茯苓12 g。所有藥物均經天津中醫藥大學第二附屬醫院中藥房鑒定為正品，水提濃縮，相當于每毫升含生藥1 g，4 ℃保存備用。陽性對照藥，馬來酸依那普利片(揚子江藥業集團江蘇制藥股份有限公司生產，規格：每片10 mg，批號：16080110)。

1.3 實驗試劑及儀器

1.3.1 實驗試劑 內皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(武漢華美，貨號CSB-E04757 r)，腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)ELISA試劑盒(武漢華美，貨號CSB-E11987 r)，大鼠CD34免疫熒光抗體(abcam，貨號ab187284)，Alexa Fluor 488標記抗兔IgG(中杉金橋，貨號ZF-0511)和Prom1 antibody(上海群已，貨號PAB12663)，磷酸鹽緩沖液(Solarbio)，多聚甲醛(Solarbio)。

1.3.2 實驗儀器 智能無創血壓計BP-98A(北京軟隆生物技術有限公司)，筒形大鼠固定器-wi108818(北京若水合科技有限公司)，小動物保溫加熱毯45 cm×45 cm(安迪教學實驗儀器)，流式細胞儀(BD accuri C6，美國)，酶標儀(Tecan infinite 2000，澳大利亞)。

1.4 實驗方法

1.4.1 實驗分組及給藥方法 本研究采用隨機、平行對照設計開展動物實驗。將50只SHR隨機分為模型組、西藥組、中藥低劑量組、中藥中劑量組和中藥高劑量組，每組10只，同時將6只WKY作為對照組，共6組。連續給藥6周，每周測量1次血壓和體重。對照組：不進行藥物干預，每日灌胃與實驗組相同體積的生理鹽水；模型組：不進行藥物干預，每日灌胃與實驗組相同體積的生理鹽水；西藥組：依那普利按3 mg/(kg·d)灌胃給藥；中藥低劑量組、中劑量組、高劑量組：分別予以天麻鉤藤飲湯劑1.0mL/(100 g·d)、1.5mL/(100 g·d)、2.0 mL/(100 g·d)灌胃給藥。

1.4.2 血壓測量 正式實驗前適應性測量實驗大鼠血壓1周，每次測量血壓時使用小動物保溫加熱毯加熱至38 ℃，SHR大鼠及WKY大鼠鼠尾預熱15～20 min，筒形固定器固定大鼠，鼠尾露出，將加壓感應器置于鼠尾根部，大鼠在清醒與安靜狀態下，無創血壓計在脈搏波型穩定5 s后自動測量。每只大鼠測量5次血壓，取平均值作為最終結果。

1.4.3 頸動脈結構病理學觀察 各組大鼠給藥6周后，均禁食12 h，末次測量血壓及稱重后，麻醉開胸取血備用，分離頸動脈，取2 cm頸動脈，生理鹽水洗凈后以10%甲醛溶液固定，進行常規石蠟包埋、切片、HE染色、光鏡觀察。

1.4.4 血管內皮相關指標檢測 VEGF和TNF-α均采用ELISA檢測，每項指標取血清50 μL，按相關試劑盒說明書進行測定。

1.4.5 循環EPCs計數測定方法 采用免疫熒光標記方法，本研究選擇CD34+、CD133+細胞為EPC。EPCs檢測步驟：取肝素鈉抗凝100 μL外周血加1 mL紅細胞裂解液，混勻，室溫下靜置10 min，中途混勻1次，以1 500 r/min離心5 min；小心吸凈上清；加入1 mL PBS混勻洗一遍，以1 500 r/min離心5 min；棄去上清，制成200 μL細胞懸液；加入CD34抗體染色，室溫避光15 min；加入固定液，混勻隔夜；加入破膜劑，洗滌后加入Alexa Fluor 488標記抗兔IgG和CD133(PROM1)抗體；加1 mL PBS混勻洗一遍，棄去上清，制成200 μL細胞懸液；采用流式細胞計數儀進行檢測。

2 結 果

2.1 各組大鼠心率、收縮壓(SBP)、平均動脈壓(MBP)和舒張壓(DBP)比較 治療前，與對照組(血壓及心率在正常范圍內)比較，其余5組SBP及心率均明顯升高(P<0.01)，組間比較差異無統計學意義(P>0.05)，具備實驗條件。與模型組比較，中藥高劑量組給藥1周后SHR大鼠DBP、MBP首先降低；給藥3周后，中藥高劑量組SHR大鼠SBP和DBP明顯降低(P<0.05)；給藥3周后，西藥組SHR大鼠SBP、DBP、MBP降低(P<0.05)。給藥6周后，與模型組比較，西藥組和中藥組高劑量組SHR大鼠降低(P<0.05)。詳見表1、圖1。

2.2 各組頸動脈血管結構 HE染色切片顯示，對照組頸總動脈血管內膜無內皮細胞脫落，無血細胞黏附，管腔規則，動脈壁厚度均勻，彈力纖維排列整齊。模型組頸動脈血管管腔規則，動脈壁厚度欠均勻，彈力纖維部分較雜亂。西藥組大鼠頸動脈血管動脈壁厚度均勻，彈性纖維較SHR組排列有序。中藥低劑量組、中劑量組、高劑量組血管病理形態觀察與西藥組相似。詳見圖2。

2.3 各組大鼠血清VEGF和TNF-α比較 治療6周后，與對照組比較，模型組和西藥組及中藥各劑量組血清VEGF、TNF-α濃度明顯升高，差異有統計學意義(P<0.01)；與模型組比較，中藥低劑量組、中劑量組、高劑量組及西藥組血清VEGF、TNF-α濃度均降低，差異均有統計學意義(P<0.01)。詳見表2、圖3。

組別只數 HR(次/min) 治療前治療3周后治療6周后對照組6362±31411±50 357±5 模型組7418±26478±321)467±221)西藥組7426±30456±241)417±561)中藥低劑量組8442±30460±311)484±281)中藥中劑量組9425±25468±461)485±151)中藥高劑量組9449±27454±231)449±41) 組別 SBP(mmHg) 治療前治療3周后治療6周后對照組140±10146±6144±9 模型組185±13199±91)211±31)西藥組192±9 184±51)2)195±121)2)中藥低劑量組190±9 195±81)198±71)中藥中劑量組182±11196±31)201±61)中藥高劑量組184±11196±71)2)196±81)2) 組別 DBP(mmHg) 治療前治療3周后 治療6周后對照組100±6104±12105±2模型組141±7158±91)157±61)西藥組142±6140±101)2)149±51)2)中藥低劑量組146±4151±71)151±51)中藥中劑量組140±3155±41)159±111)中藥高劑量組142±6147±91)2)153±41)2)

注：1 mmHg=0.133 kPa。與對照組比較，1)P<0.01；與模型組比較，2)P<0.05

A為SBP；B為DBP；C為MBP；D為心率

圖2 各組大鼠頸動脈結構(HE染色，×400)

組別只數TNF-αVEGF對照組 679.10±3.03 33.93±1.09 模型組 7131.62±3.861) 52.44±1.521) 西藥組 789.93±3.131)2)44.92±3.611)2)中藥低劑量組8118.86±6.231)2)46.65±4.211)2)中藥中劑量組9102.81±2.631)2)44.04±1.581)2)中藥高劑量組997.55±2.481)2)41.05±1.211)2)

與對照組比較，1)P<0.01；與模型組比較，2)P<0.01

a為VEGF；b為TNF-α。與對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01圖3 用藥6周各組血清VEGF、TNF-α表達

2.4 各組SHR大鼠循環EPCs影響 治療6周后，流式細胞檢測結果顯示，與對照組比較，模型組循環EPCs所占比例明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，西藥組及中藥各劑量組循環EPCs所占比例均升高，且西藥組及中藥高劑量組升高更明顯，差異有統計學意義(P<0.05)。詳見表3、圖4。

組別只數ECPs比例對照組60.57±0.06模型組70.30±0.091)西藥組70.55±0.122)中藥低劑量組80.35±0.11中藥中劑量組90.41±0.21中藥高劑量組90.55±0.172)

與對照組比較，1)P<0.05；與模型組比較，2)P<0.05

A為CD34PE/CD133(Prom-1) Alexa Fluor 488二維圖；B為CD133(Prom-1)Alexa Fluor 488直方圖；C為CD34PE直方圖

圖4流式細胞計數檢測圖

3 討 論

高血壓病是全身細小動脈持續痙攣硬化，周圍循環阻力增加引起血壓上升，基本病理變化是細小動脈病變。高血壓持續作用下，全身細小動脈發生玻璃樣變，中層平滑肌細胞增殖，內膜纖維組織和彈力纖維組織增生，血管管腔狹窄。血管內皮細胞功能障礙與高血壓發生發展密切相關。血管內皮細胞分泌的多種血管活性物質，可調節血管收縮、舒張及維持血管張力。

高血壓進程中，由于血管內皮損傷，VEGF可特異性地刺激血管內皮細胞增殖。有研究認為，高血壓病人血清VEGF水平增加是機體的一種代償反應，其作用是維持動脈粥樣硬化狀態下血管內皮細胞的正常功能，可促進受損內皮細胞修復[3]。TNF-α是一種炎性細胞因子，與炎癥反應、組織損傷密切相關，可增加血管內皮通透性，內皮舒縮功能障礙，內皮細胞凋亡，引起血管內膜增生管腔變窄，促進高血壓發生。多項研究發現，高血壓病發生發展過程的血管內皮損傷可能引起血TNF-α水平增高[4-5]，TNF-α導致的內皮功能障礙可能是高血壓靶器官損害與合并癥的重要因素[6]。

EPCs是一類具有特異性歸巢于損傷區域并分化增殖為成熟血管內皮細胞的前體細胞。EPCs主要源自骨髓，可對刺激、組織缺血和血管損傷產生應答，動員到外周血并遷移、歸巢到缺血或損傷部位，并在靶區域增殖、分化為內皮細胞。EPCs對受損血管內皮具有修復作用。相關研究發現，SHR動物模型[7]和醋酸去氧皮質酮誘導的鹽敏感性高血壓大鼠模型[8]EPCs數量與增殖、黏附、遷移能力均較正常對照組明顯降低。頑固性高血壓病人循環血液EPCs數量及增殖能力均明顯下降；血液EPCs數量越低，收縮壓越高[7，9]。

天麻鉤藤飲由天麻、鉤藤、石決明、杜仲等11味中藥配伍組成，是治療肝陽上亢型高血壓病的經典方劑，也是平肝潛陽治療的代表藥物。本研究結果顯示，依那普利及中藥天麻鉤藤飲均能降低SHR大鼠血壓，隨著大鼠鼠齡增加血壓持續上升，藥物治療能抑制高血壓升高。與模型組比較，中藥高劑量組及西藥組用藥3周后能明顯降低SHR大鼠SBP和DBP(P<0.05)。與對照組比較，模型組VEGF及TNF-α均升高，EPCs數量降低，西藥組及中藥高劑量組可一定程度降低VEGF和TNF-α水平，升高EPCs水平，差異有統計學意義(P<0.05)。

天麻鉤藤飲具有促進血管內皮損傷修復、抑制內皮細胞凋亡、減輕血管炎性反應的作用，對血管內皮的保護作用表現為動員EPCs，升高SHR外周血EPCs數量，以促進損傷內皮的修復。