p38MAPK抑制劑聯合輔酶Q10對氧化應激條件下大鼠心肌細胞的保護作用

張思潔，吳亞瓊，李星濤

河北醫科大學第四醫院心內科石家莊050000

心血管系統疾病是一種嚴重影響人類生活質量的常見疾病，心肌梗死、心力衰竭等常伴隨心肌組織氧化損傷，而氧化應激是目前為止人們發現的心肌損傷發生的起始因素［1］。輔酶Q10常用于治療高血壓、心力衰竭、心絞痛等心血管系統疾病，具有清除自由基、維持細胞穩定、抑制心肌細胞凋亡等作用［2-3］。p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinases，p38MAPK)是 MAPK信號通路中最為重要的分支之一，其對于細胞凋亡、炎癥反應、氧化應激等均具有重要的調控作用［4］。很多研究［5-8］表明，p38MAPK在糖尿病心肌病、心肌缺血再灌注、藥物誘導的心肌毒性、心力衰竭等多種心肌損傷中過度激活，并且參與心肌細胞氧化損傷過程。本研究觀察了輔酶Q10和p38MAPK抑制劑單用以及二者聯用對大鼠心肌細胞氧化應激損傷的作用，并初步探討其可能機制。

1 材料與方法

1．1 材料 大鼠H9c2心肌細胞購自百恩維生物科技有限公司，p38MAPK抑制劑SB203580購自美國ApexBio科技公司，輔酶Q10購自西南藥業股份有限公司，丙二醛(MDA)含量檢測試劑盒購自上海篤瑪生物科技有限公司，p38MAPK抗體購自北京博奧森生物技術有限公司，磷酸化 p38MAPK(pp38MAPK)抗體購自美國CST公司，C-caspase-3抗體購自美國CST公司，超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測試劑盒、乳酸脫氫酶(LDH)含量檢測試劑盒購自美國Abnova公司，過氧化氫酶(CAT)活性檢測試劑盒購自美國Cell Biolabs公司。

1．2 實驗分組 H9c2細胞分為5組，對照組常規培養，模型組給予100μmol/L過氧化氫處理以建立氧化應激模型，輔酶Q10組給予100μmol/L過氧化氫、0．3 g/L輔酶 Q10處理，SB203580組給予100 μmol/L過氧化氫、10μmol/L SB203580處理，輔酶Q10+SB203580組給予100μmol/L過氧化氫、0．3 g/L輔酶Q10、10μmol/L SB203580處理。培養條件:體積分數5%CO2、37℃，體積分數10%胎牛血清的DMEM細胞培養液中培養。

1．3 各組細胞p38MAPK磷酸化水平檢測 采用Western blot法。H9c2細胞按1．2分組處理24 h后，提取蛋白并用BCA法定量，之后電泳、轉膜，加入50 g/L牛血清白蛋白溶液，室溫封閉2 h，再將膜放在抗體反應液中孵育結合，p38MAPK、p-p38MAPK一抗按1∶800稀釋，二抗按1∶4 000稀釋。用增強型化學發光試劑盒發光以后，室溫孵育5 min。掃描圖像，以目的條帶和內參GAPDH條帶灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達量。實驗重復3次。

1．4 各組細胞LDH漏出率檢測 H9c2細胞按1．2分組處理24 h后，分別收集培養液上清及細胞，采用二硝基苯肼顯色法，按照LDH含量檢測試劑盒步驟測定LDH含量。總LDH含量=上清中LDH含量+細胞中LDH含量，LDH漏出率=(上清中LDH含量/總LDH含量)×100%。實驗重復3次。

1．5 各組細胞存活率檢測 H9c2細胞接種于96孔板，接種密度為1×104個/孔，分別按1．2分組處理24 h后，每孔添加5 g/L的MTT溶液20μL，37℃孵育4 h后，添加二甲基亞砜，待結晶溶解以后，以酶標儀測定560 nm波長處的吸光度(A)值，用不含細胞的孔調零。存活率=(處理組A值/對照組A值)×100%。實驗重復3次。

1．6 各組細胞凋亡檢測 H9c2細胞按1．2分組處理24 h后，添加2．5 g/L胰蛋白酶消化，收集細胞，與300μL緩沖液混合，添加Annexin V-FITC和PI工作液各5μL，用流式細胞儀檢測前再添加200μL結合緩沖液。計算細胞凋亡率。實驗重復3次。

1．7 各組細胞中C-caspase-3蛋白表達水平檢測H9c2細胞按1．2分組處理24 h后，以Western blot法檢測細胞中C-caspase-3蛋白表達，C-caspase-3抗體按1∶600稀釋，余步驟同1．3。實驗重復3次。

1．8 各組細胞中SOD、CAT活性及MDA含量檢測 H9c2細胞按1．2分組處理24 h后，收集細胞，采用硫代巴比妥酸法檢測細胞中MDA含量，用黃嘌呤氧化法檢測細胞中SOD活性，用鉬酸銨法檢測細胞中CAT活性，均按試劑盒說明操作。實驗重復3次。

1．9 統計學處理 采用SPSS 21．0處理數據。應用單因素方差分析比較各組細胞上述指標的差異，組間比較用SNK-q檢驗，檢驗水準α=0．05。

2 結果

2．1 各組細胞中p38MAPK磷酸化水平檢測結果結果見圖1、表1。由圖1、表1可知，過氧化氫能夠提高心肌細胞中p38MAPK磷酸化水平，而輔酶Q10和SB203580均能降低過氧化氫誘導的p38MAPK磷酸化水平升高，二者聯用，p38MAPK磷酸化水平進一步降低。

圖1 各組細胞中p-p38M APK和p38M APK的表達

表1 各組細胞中p-p38MAPK和p38MAPK水平比較(n=3)

2．2 各組細胞LDH漏出率和存活率檢測結果結果見表2。由表2可知，過氧化氫能夠提高心肌細胞LDH漏出率，降低心肌細胞存活率;輔酶Q10和SB203580能夠抑制過氧化氫誘導的心肌細胞LDH漏出率升高和細胞存活率降低，二者聯用作用更強。

表2 各組細胞LDH漏出率和存活率比較(n=3) %

2．3 各組細胞凋亡率和C-caspase-3蛋白表達水平檢測結果 結果見圖2和表3。由圖2、表3可知，過氧化氫能夠提高心肌細胞凋亡率和C-caspase-3蛋白水平;輔酶Q10和SB203580能夠抑制過氧化氫誘導的心肌細胞凋亡和C-caspase-3蛋白表達，二者聯用作用更強。

圖2 各組細胞C-caspase-3蛋白的表達

表3 各組細胞凋亡率和C-caspase-3蛋白表達水平比較(n=3)

2．4 各組細胞中SOD、CAT活性及MDA含量檢測結果 結果見表4。由表4可知，過氧化氫能夠提高心肌細胞中MDA水平，降低細胞中SOD、CAT活性;輔酶Q10和SB203580能夠抑制過氧化氫誘導的心肌細胞SOD、CAT活性降低和MDA含量升高，并且二者聯用作用更強。

表4 各組細胞中SOD、CAT活性及MDA含量比較(n=3)

3 討論

輔酶Q又名泛醌，是一種存在于細胞膜中的化合物，不同來源的輔酶Q的側鏈上異戊烯單位數量不同，人類輔酶Q異戊烯單位數量為10，因此又稱為輔酶Q10［9］。輔酶Q10具有抑制細胞凋亡、抗氧化、增強免疫、保護神經系統等多種作用，目前發現輔酶Q10對于帕金森綜合征、糖尿病、心肌病、腫瘤等具有治療作用［10-13］。有關心肌缺血再灌注損傷的研究［14］顯示，輔酶Q10能夠抑制心肌細胞中氧自由基的產生并促進其降解，在心室功能和結構維持中具有保護作用。針對體外缺氧復氧致心肌細胞損傷的研究［15］表明，輔酶Q10能夠抑制心肌細胞凋亡，提高心肌細胞活性。本研究結果顯示，輔酶Q10可以提高氧化應激條件下心肌細胞的活性，并減少細胞LDH漏出率，提示輔酶Q10對于過氧化氫誘導的心肌細胞損傷具有保護作用。

p38MAPK作為一種重要的信號轉導通路在人體組織中廣泛表達，參與腫瘤、心血管系統疾病、神經損傷等的發生［16-18］。近年來的研究［5-8］表明，心肌缺血再灌注損傷、糖尿病心肌病、藥物誘導的心肌病等的發生均與p38MAPK活化有關，p38MAPK信號在受到外界因素刺激以后能夠誘導心肌細胞凋亡，降低心肌細胞活性，造成心肌細胞損傷。本研究結果顯示，p38MAPK抑制劑可以提高氧化應激條件下心肌細胞活性，減少細胞凋亡，具有抗心肌細胞氧化應激的作用。另外，過氧化氫處理后的心肌細胞p38MAPK信號通路被激活，而輔酶Q10能夠降低p38MAPK蛋白的磷酸化水平，提示輔酶Q10減輕過氧化氫誘導的心肌細胞損傷的機制可能與p38MAPK信號通路有關。

細胞中過量的氧自由基可以誘導細胞凋亡。細胞內氧自由基的積累與細胞中抗氧化酶活性降低有關，SOD、CAT是細胞內重要的抗氧化酶，其活性降低可以直接導致細胞中氧自由基清除受阻;細胞內過量的氧自由基可以誘導細胞中正常的脂質發生過氧化，生成大量的MDA［19］。另外，氧自由基可以誘導細胞中 Caspase活化，導致細胞凋亡發生，Caspase-3是細胞凋亡的執行因子，其活化水平升高是細胞凋亡發生的標志［20］。本研究顯示，p38MAPK抑制劑和輔酶Q10單獨使用均可以提高心肌細胞中SOD、CAT活性，減少MDA產生，減少細胞中活化的Caspase-3蛋白的表達，降低細胞凋亡率，并且p38MAPK抑制劑和輔酶Q10聯合使用效果更優。

總之，p38MAPK抑制劑聯合輔酶Q10可抑制氧化應激誘導的心肌細胞損傷，p38MAPK抑制劑可能是提高輔酶Q10治療心肌損傷的潛在途徑。