胃腺癌中ceRNA網絡的構建和m iR-204-5p、HOXC8基因的表達及其相關性檢測

王 蕾，任凱凱，馬佳康，陳小華，張萌迪，李丹丹，李曉娜，馬 軍

1)鄭州大學第二附屬醫院消化疾病研究所鄭州450014 2)鄭州大學第二附屬醫院腫瘤科鄭州450014 3)漯河市中心醫院消化內科河南漯河426499 4)鄭州大學第二附屬醫院放射科鄭州450014 5)鄭州大學第二附屬醫院檢驗科鄭州450014

胃癌的發生、發展與遺傳、環境及細菌感染有關，據2018年報道的統計數據，全球胃癌分別位于惡性腫瘤發病率的第5位、死亡率的第2位，提示胃癌的惡性程度較高且預后不佳［1］。胃癌是我國常見的惡性腫瘤之一。通過更多的分子特征的研究，有助于了解胃癌的發生發展機制，探索更為有效地診療靶點。近幾年來，非編碼RNA的功能逐漸被大家所認識，包括長鏈非編碼RNA(lncRNA)和微小RNA(miRNA)等。miRNA是一類長為21～23個核苷酸的非編碼小RNA分子，通過基因轉錄后調控與抑制靶基因的表達等途徑來發揮作用。lncRNA又可作為競爭性內源RNA(ceRNA)調控相關miRNA的功能，形成細胞內復雜的調控網絡。文獻［2-5］報道，有300余個miRNA和胃癌有關，其中miR-204-5p在胃癌中低表達，和胃癌的發生發展關系密切。本研究利用TCGA數據庫構建了胃腺癌ceRNA網絡，分析重要節點基因 miR-204-5p及其靶基因HOXC8在胃腺癌中的表達情況，為研究胃腺癌的發生發展機制奠定基礎。

1 材料與方法

1．1 TCGA數據分析和ceRNA網絡構建 從TCGA 數據庫(https://cancergenome．nih．gov/)中下載胃腺癌 mRNA和 miRNA測序數據(版本2018．2．23)，使用R語言“edgeR”包篩選差異表達基因，篩選條件為差異倍數＞2且校正P值＜0．05。利用miRcode、starBase、miRDB、miRTarBase、TargetScan 等數據庫和在線工具，預測差異表達基因的靶向調節關系，構建lncRNA-miRNA-mRNA的ceRNA調控網絡，利用Cytoscape V3．5．1軟件進行作圖。

1．2 病例收集 收集鄭州大學第二附屬醫院初診初治的胃腺癌手術標本32例，其中男23例，女9例，患者年齡(57±14)歲，均經病理證實。同時收集癌旁正常黏膜組織(手術切緣取材，距癌組織＞5 cm，且經病理證實)。標本液氮速冷后存于－80℃冰箱備用。

1．3 細胞系和主要試劑 胃腺癌SGC7901細胞系(ATCC)為本實驗室保存。Trizol(15596018)、miRNA反轉錄試劑盒(G903;含加polyA尾酶)、mRNA反轉錄試劑盒(G492)均購自 Ambion公司，qRTPCR試劑為含ROX的SYBRGreen(上海羅氏制藥有限公司，04913914001)。引物和miRNA模擬物及其對照均由上海生工生物工程公司設計并合成(表1)，轉染試劑為銳博生物技術公司產品(Ribo-FECTCP)。

表1 所用引物和m iRNA序列表

1．4 胃腺癌組織中m iR-204-5p和HOXC8 m RNA表達的qRT-PCR檢測 用Trizol裂解凍存的新鮮組織，提取總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質量，紫外分光光度儀測定濃度。按試劑盒說明反轉錄，然后用SYBR Green法進行PCR，檢測miR-204-5p和HOXC8 mRNA的表達，具體實驗方法參見試劑盒說明書。U6為檢測miR-204-5p的內參;β-actin作為HOXC8 mRNA檢測的內參;表達量用2－ΔΔCt計算。

1．5 m iR-204-5p模擬物轉染后SGC7901細胞中HOXC8 mRNA表達的qRT-PCR檢測 SGC7901細胞接種于24孔板(2×105個/孔)，37℃、體積分數5%CO2培養箱中培養，培養基為含體積分數10%胎牛血清的RPMI 1640，第2天細胞達70%融合時進行細胞轉染。轉染試劑用RioFECT，按照說明書進行操作。miR-204-5p模擬物終濃度為50 nmol/L，每孔用轉染試劑3μL，48 h后收集細胞進行qRT-PCR檢測基因RNA表達量(實驗方法同1．4)。分別用未轉染和無關序列轉染作為空白或無關對照組。

1．6 統計學處理 采用SPSS 21．0進行數據分析。應用非參檢驗(Wilcoxon)分析胃腺癌和癌旁組織中miR-204-5p和HOXC8mRNA表達水平的差異，應用t檢驗分析miR-204-5p模擬物轉染后SGC7901細胞中HOXC8 mRNA表達的差異，檢驗水準α=0．05。

2 結果

2．1 胃腺癌中重要的ceRNA調控網絡的構建 從TCGA數據庫下載的胃腺癌測序數據中，剔除3個未明確顯示胃腺癌診斷的病例，共得到mRNA和ln-cRNA胃癌數據374個，正常數據32個;miRNA胃癌數據443個，正常數據45個。數據合并為矩陣后，按照篩選標準，得到差異表達 lncRNA、miRNA和mRNA(圖 1)，并構建了 lncRNA-miRNA-mRNA的ceRNA調控網絡。圖1顯示，miR-204是重要的調控節點，其在胃腺癌中表達下調。經在線預測，miR-204-5p和HOXC8基因的3’UTR區有結合位點，兩者有靶向調節關系(圖2)。

圖1 依據TCGA數據構建的胃腺癌lncRNA-m iRNA-m RNA的ceRNA調控網絡

圖2 m iR-204-5p和HOXC8靶向關系圖

2．2 m iR-204-5p和HOXC8 mRNA在胃腺癌組織中的表達 與癌旁正常組織組織{［(3．24(1．20，4．44)］和［1．20(0．11，1．31)］}相比，胃腺癌組織中miR-204-5p mRNA［1．9(0．34，2．25)］低表達，而HOXC8 mRNA 高表達［3．6(2．82，6．42)］(Z=3．254和4．263，P ＜0．001)。

2．3 m iR-204-5p模擬物轉染對SGC7901細胞中HOXC8 m RNA表達的影響 與無關對照組(0．955±0．137)相比，轉染 miR-204-5p 模擬物的SGC7901細胞中 HOXC8 mRNA的表達(0．505±0．078)明顯下調(t=2．864，P=0．046)。

3 討論

miRNA 最早發現于 1993年［6］，在核內是由RNA聚合酶Ⅱ轉錄形成的轉錄產物(pri-miRNA)，其后在核酸酶Drosha和輔助因子DGCR8/Pasha所構成的微處理器復合體中剪切成長為60～70個核苷酸的miRNA前體(pre-miRNA)，隨后再分解為miRNA。miRNA主要存在于胞漿中，通過結合到靶基因的3’UTR區;通過抑制翻譯或促進mRNA降解，起到轉錄后調控靶基因表達的作用。可以通過生物信息學分析預測miRNA的靶向mRNA。

有文獻［7-10］對TCGA數據庫中的胃癌測序數據進行分析，并構建了ceRNA調控網絡，發現 miR-204-5p是胃腺癌中重要的差異表達基因。

研究［2，5，11-13］顯示，miR-204-5p 在胃癌中低表達，有抑癌基因的作用，對胃癌細胞上皮間質轉換、侵襲和遷移有抑制作用，并促進化療藥物療效;外周血中miR-204水平降低的胃癌患者預后較差［14］。本研究通過TCGA數據分析，發現miR-204-5p在胃腺癌中低表達，并通過檢測胃腺癌患者的癌和癌旁正常黏膜組織標本驗證了這一結果。

本研究通過多個數據庫預測，發現HOXC8是miR-204-5p的靶基因，目前尚無文獻對兩者的靶向關系進行實驗驗證。HOXC8在多種腫瘤中高表達，作為癌基因，具有促進腫瘤轉移、增殖等作用，但在胃腺癌中的作用尚不明確［15-17］。

本研究中生物信息學預測和胃腺癌組織檢測結果均提示miR-204-5p和HOXC8存在ceRNA調控關系，胃腺癌中miR-204-5p表達下調可能會導致HOXC8表達上調，并通過促進癌細胞增殖、侵襲和遷移、抑制凋亡等作用機制，造成腫瘤的發生和發展。因此，本研究用miR-204-5p模擬物轉染胃腺癌SGC7901細胞系，發現轉染后(48 h)可明顯抑制HOXC8mRNA的表達水平，其抑制效率達到50%左右。這些結果提示，miR-204-5p作為ceRNA，可能和HOXC8形成一個調節通路。另外，miR-211-5p和miR-204-5p有相同的結合靶點，但它在胃腺癌中無表達異常，該基因的功能是否和miR-204-5p有相互影響，尚需要進一步實驗證實。