高效液相色譜法檢測(cè)不同施肥栽培黃芪的毛蕊異黃酮葡萄糖苷及黃芪甲苷含量

王亞麗，田曼，王昌利，顏永剛，張崗

黃芪為豆科植物蒙古黃芪［Astrɑgɑlus membrɑnɑceus（Fisch.）Bge.vɑr.mongholicus（Bge.）Hsiɑo］或膜莢黃芪［Astrɑgɑlus membrɑnɑceus（Fisch.）Bge.］的干燥根。黃芪含多種化學(xué)成分，毛蕊異黃酮葡萄糖苷和黃芪甲苷是其主要活性成分，具有抗炎、降血糖、調(diào)節(jié)免疫、強(qiáng)心和保護(hù)肝臟等作用，對(duì)心腦血管疾病，糖尿病及肝損傷等疾病有良好的療效［1-6］。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，高星等［7］研究了氮、磷、鉀三種肥料元素的不同配比對(duì)黃芪中黃酮類及皂苷類成分的影響，張金文［8］研究了有機(jī)與無(wú)機(jī)復(fù)混配方肥不同施用量對(duì)黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷及黃芪甲苷含量的影響，而單施有機(jī)肥、化學(xué)肥及其施肥量對(duì)黃芪中主要有效成分毛蕊異黃酮葡萄糖苷和黃芪甲苷的含量影響卻少見(jiàn)報(bào)道。《中藥材生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》（國(guó)家藥品監(jiān)督管理局令第32號(hào)）要求施肥種類以有機(jī)肥為主，根據(jù)不同藥用植物生長(zhǎng)發(fā)育的需求有限度地使用化學(xué)肥料。本實(shí)驗(yàn)于2016年3—11月設(shè)計(jì)了有機(jī)肥和化學(xué)肥2種肥料種類的12種不同施肥處理，采用高效液相色譜法（HPLC）比較分析了黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷及黃芪甲苷含量的差異，為進(jìn)一步研究黃芪栽培中合理施肥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1儀器Waters 2695高效液相色譜儀，Waters 2996二極管陣列檢測(cè)器（DAD），Waters 2420蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD）。

1.2試藥黃芪藥材樣品采自甘肅省宕昌縣步長(zhǎng)集團(tuán)黃芪種植基地，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)王繼濤高級(jí)實(shí)驗(yàn)師鑒定為豆科植物蒙古黃芪的干燥根。

毛蕊異黃酮葡萄糖苷（批號(hào)10305-201702）、黃芪甲苷（批號(hào)10212-201603）對(duì)照品均購(gòu)于南昌貝塔生物科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%，實(shí)驗(yàn)用水為杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司的娃哈哈純凈水，乙腈和甲醇為美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司的色譜純，甲酸為天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司的色譜純，其他試劑均為分析純。

1.3研究方法施肥實(shí)驗(yàn)共設(shè)12個(gè)處理，肥料種類及施肥量的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。2016年2月27日施肥，肥料作基肥，黃芪種苗于2016年3月4日移栽，栽培方式為不覆膜平地開(kāi)溝栽植，小區(qū)之間開(kāi)30 cm×50 cm溝，每小區(qū)面積為24 m2，采用南北行向，長(zhǎng)×寬=6 m×4 m，實(shí)驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，各處理重復(fù)3次，各處理田間管理水平相同。于2016年11月5日收獲，干燥后采用HPLC-DAD測(cè)定毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量，HPLC-ELSD測(cè)定黃芪甲苷含量。

表1 黃芪栽培采用施肥肥料的種類及施肥量

1.4色譜條件

1.4.1毛蕊異黃酮葡萄糖苷色譜條件 色譜柱為Waters Symmetry C 18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫30℃；流動(dòng)相為0.2%甲酸（A）-乙腈（B），梯度洗脫0～30 min，15%B→30%B；30～40 min，30%B→15%B；系統(tǒng)平衡時(shí)間10 min；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm。

1.4.2黃芪甲苷色譜條件 色譜柱為Waters Symmetry C 18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫30 ℃；流動(dòng)相為乙腈-水（32：68）；流速 1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；ELSD漂移管溫度60℃，噴霧器溫度36℃，增益值130，供氣壓力172.38 kPa。

1.5對(duì)照品溶液的制備精密稱定毛蕊異黃酮葡萄糖苷1.65 mg，置5 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，超聲溶解作為對(duì)照品溶液C。精密稱定黃芪甲苷0.74 mg，置5 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，超聲溶解作為對(duì)照品溶液D。

1.6供試品溶液的制備將甘肅省宕昌縣黃芪藥材在50℃烘箱中干燥24 h，打粉，過(guò)45目篩，精密稱量粉末5.0 g，置500 mL圓底燒瓶中，精密加入80%甲醇200 mL，浸12 h后，加熱回流提取3次，每次1 h，過(guò)濾，濾液蒸干，加100 mL水溶解殘?jiān)瑢⑷芤恨D(zhuǎn)移到分液漏斗中，石油醚萃取3次，每次200 mL，棄去石油醚層，將非石油醚層轉(zhuǎn)移到蒸發(fā)皿中，濃縮干燥，加甲醇定容到10 mL量瓶中，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用Excel 2013、SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，多組計(jì)量資料比較采用方差分析，組間多重比較使用最小顯著性差異法（LSD），兩計(jì)量資料關(guān)系采用線性回歸及相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1線性關(guān)系考察

2.1.1毛蕊異黃酮葡萄糖苷線性關(guān)系考察 將“1.5”項(xiàng)下對(duì)照品溶液C按“1.4.1”色譜條件依次進(jìn)樣1、5、10、15、20、25 μL，重復(fù)測(cè)定3次，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X），峰面積值為縱坐標(biāo)（Y），線性回歸方程為：Y?1=3 022 248.15x+121 954.72，r1=0.999 9，P1＜0.001，相關(guān)性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明毛蕊異黃酮葡萄糖苷在0.33～8.25 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。色譜圖見(jiàn)圖1。

2.1.2黃芪甲苷線性關(guān)系考察 將“1.5”項(xiàng)下對(duì)照品溶液D按“1.4.1”色譜條件依次進(jìn)樣1、5、10、15、20、25 μL，重復(fù)測(cè)定3次，以進(jìn)樣量的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)（X），峰面積的對(duì)數(shù)（Y）為縱坐標(biāo)，線性回歸方程為：Y?2=0.981 1x+5.606 7，r2=0.999 0，P2＜0.001，相關(guān)性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明黃芪甲苷在0.146～3.65 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。色譜圖見(jiàn)圖2。

2.2測(cè)定結(jié)果精密稱取不同施肥處理的黃芪粉末，按“1.6”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“1.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，分別計(jì)算毛蕊異黃酮萄糖苷及黃芪甲苷含量。對(duì)不同施肥處理的各實(shí)驗(yàn)小區(qū)單根重、毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量、毛蕊異黃酮葡萄糖苷積累量、黃芪甲苷含量和黃芪甲苷積累量進(jìn)行方差分析。方差分析的結(jié)果表明，不同施肥各處理間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），說(shuō)明不同施肥處理對(duì)黃芪單根重、毛蕊異黃酮葡萄糖苷和黃芪甲苷含量有影響，結(jié)果見(jiàn)表2。

圖1 毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品（A）及黃芪樣品（B）色譜圖

圖2 黃芪甲苷對(duì)照品（A）及黃芪樣品（B）色譜圖

表2 不同施肥處理黃芪單根重、毛蕊異黃酮葡萄糖苷和黃芪甲苷含量及積累量方差分析

進(jìn)一步對(duì)各處理采用LSD法進(jìn)行多重比較，結(jié)果見(jiàn)表3。處理B單根重最重，為（56.88±2.46）g，約為處理A的1.4倍，除了與處理F之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，與其他處理均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量及其積累量均以處理B最高，分別約為處理A的4.6倍和6.3倍，處理F次之，分別約為處理A的4.4倍和5.6倍，處理B、F均與處理A差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；黃芪甲苷含量及其積累量均以處理F最高，分別約為處理A的2.6倍和3.4倍，其次為處理B，分別約為處理A的2.4倍和3.3倍，處理B、F之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與處理A差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。施肥栽培的11種處理方式，毛蕊異黃酮葡萄糖苷、黃芪甲苷的含量及積累量均顯著高于不施肥栽培（處理A），整體而言，處理B下的毛蕊異黃酮葡萄糖苷、黃芪甲苷的含量及積累量最高。

3 討論

3.1提取方法的考察通過(guò)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，同時(shí)提取黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷和黃芪甲苷成分主要是超聲提取和加熱回流提取［9-12］，提取溶劑多為甲醇和95%乙醇，本實(shí)驗(yàn)為提高毛蕊異黃酮葡萄糖苷和黃芪甲苷提取率，在現(xiàn)有文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上分別考察了超聲提取和加熱回流提取方法，同時(shí)還考察了不同提取溶劑、提取時(shí)間和提取次數(shù)對(duì)提取率的影響，最終結(jié)果表明，80%甲醇加熱回流提取3次，每次提取1 h效率最高。參照2015年版中國(guó)藥典中黃芪項(xiàng)下黃芪甲苷的含量測(cè)定方法，本實(shí)驗(yàn)方法與藥典中的方法相比，省去了水飽和正丁醇萃取、氨試液及D101型大孔吸附樹脂柱洗脫步驟，簡(jiǎn)化了樣品處理方法。

3.2含量測(cè)定結(jié)果分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，相比不施肥處理，有機(jī)肥處理和化學(xué)肥處理對(duì)黃芪單株根重和黃芪中的毛蕊異黃酮葡萄糖苷、黃芪甲苷的含量均有所增加，且各施肥處理下黃芪中的毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量均達(dá)到《中國(guó)藥典》2015年版一部的標(biāo)準(zhǔn)，黃芪甲苷含量在施尿素量為20 kg/667 m2和過(guò)磷酸鈣15 kg/667 m2處理下低于藥典標(biāo)準(zhǔn)，其余各施肥處理下的黃芪甲苷含量均達(dá)到《中國(guó)藥典》2015年版一部的標(biāo)準(zhǔn)，分析其原因可能是因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)提取方法與藥典相比省去了氨試液洗脫，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，氨試液可以將樣品中其他皂苷類成分在堿的作用下水解掉乙酰基而提高黃芪甲苷的含量［13］。由于本實(shí)驗(yàn)未經(jīng)過(guò)氨試液處理，從而降低了黃芪中其他皂苷類成分向黃芪甲苷的轉(zhuǎn)化，這更加準(zhǔn)確地檢測(cè)出黃芪藥材中以原型存在的黃芪甲苷的含量。毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量及積累量在施尿素量為10 kg/667 m2處理下最高，黃芪甲苷含量及積累量在施尿素量為10 kg/667 m2處理下居第2，兩種有效成分的含量及積累量均高于施尿素量為15 kg/667 m2和20 kg/667 m2，說(shuō)明施尿素肥在一定范圍內(nèi)有助于提高黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷和黃芪甲苷的含量，但尿素施肥量過(guò)高反而不利于這兩種有效成分的積累。在單施有機(jī)肥和磷酸二銨中，整體而言，以施有機(jī)肥量為3 600 kg/667 m2處理下毛蕊異黃酮葡萄糖苷和黃芪甲苷含量相對(duì)較高，但對(duì)提高黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷和黃芪甲苷含量的效果卻不及過(guò)磷酸鈣和尿素。

表3 不同施肥處理黃芪單根重、毛蕊異黃酮葡萄糖苷和黃芪甲苷含量及積累量（n=3）

總之，合理施肥對(duì)于改善藥材品質(zhì)具有重要意義，本研究在不同施肥種類的基礎(chǔ)上，初步研究了不同施肥量對(duì)黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷及黃芪甲苷含量的影響，為進(jìn)一步研究黃芪栽培的合理施肥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。