產細菌素乳酸菌的篩選及發酵條件優化

滿麗莉，向殿軍

（1.內蒙古民族大學生命科學學院，內蒙古通遼 028042；2.內蒙古民族大學農學院，內蒙古通遼 028042）

0 引 言

在《“十三五”國家食品安全規劃》中強調食品安全的重要性[1]。添加食品防腐劑是防止食品腐敗變質、確保食品安全及延長食品貨架期的主要方法，因此，尋求天然、廣譜、高效的食品防腐劑是目前食品科學研究中的熱點問題。乳酸菌細菌素作為一種新型生物防腐劑備受關注，但目前商品化的乳酸菌細菌素僅限于pediocin PA-1和Nisin等少數幾種，原因在于許多乳酸菌細菌素pH范圍窄、熱不穩定、抑菌譜窄或產量相對較低，在食品中的應用受限[2]。目前篩選到的產細菌素乳酸菌大多對革蘭氏陽性菌具有較高的抑菌活性，而對于革蘭氏陰性菌基本無抑菌活性或抑菌活性較弱，篩選對革蘭氏陰性菌有抑菌活性的乳酸菌細菌素已成為研究熱點之一[3-4]。產細菌素乳酸菌菌株的來源較為廣泛如奶酪、酸乳、發酵牦牛乳、南非大麥啤酒、面糊、波斯鱘魚、低鹽發酵魚等[5-7]，我國是一個乳酸菌資源豐富的國家，內蒙古地區傳統發酵乳制品中乳酸菌資源尤為豐富，進行乳酸菌細菌素的研究具有得天獨厚的優勢。產細菌素乳酸菌的篩選鑒定是深入研究細菌素特性、合成量、純化、應用等的基礎，有利于保障人民的身體健康，具有重要的經濟價值和社會效益。

細菌素產量低是乳酸菌細菌素應用受限的主要原因之一，優化培養條件和培養基是提高細菌素合成量的有效策略之一，例如：采用該策略提高乳酸片球菌ITV26所產乳酸片球菌素和植物乳桿菌KC21所產植物乳桿菌素的合成量[8,9]。細菌素的微生物發酵過程較為復雜，理解和優化發酵過程是一個關鍵步驟，響應面法（Response surface methodology，RSM）在生物過程優化已得到廣泛應用，通過響應面法建?？蔀榧毦匕l酵過程的分析、設計和操作提供有用的信息，獲得細菌素的優化發酵條件[10]。

本研究以來自于內蒙古自治區后旗、扎旗、科爾沁右翼中旗、赤峰地區的酸馬奶為供試樣品，篩選對革蘭氏陰性菌-鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028具有抑菌活性的菌株，通過個體形態、菌落形態、16SrDNA基因同源性比對及系統進化樹構建確定菌株屬種，采用水解酶敏感性試驗進一步確定篩選到的是產細菌素菌株。應用單因素試驗和響應面法優化細菌素合成的發酵條件，為更好地實現細菌素的開發及應用提供一定的方法參考和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試樣品及模式菌株

供試樣品為來自于內蒙古自治區后旗、扎旗、科爾沁右翼中旗、赤峰地區的酸馬奶。指示菌菌株：鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028購自廣東環凱微生物科技有限公司。

1.1.2 試劑、培養基及主要儀器設備

1.1.2.1 試劑

過氧化氫酶購自美國Sigma公司；細菌基因組提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；M 17培養基和營養肉湯培養基購自青島高科園海博生物技術有限公司；Marker、Taq聚合酶等購自寶生物工程（上海）有限公司；其它藥品均為國產分析純。

1.1.2.2 培養基

MRS培養基：蛋白胨5.0 g，牛肉膏5.0 g，胰蛋白胨10.0 g，酵母粉5.0 g，Tween-80 1.0 g，葡萄糖20.0 g，硫酸錳0.25 g，乙酸鈉5.0 g，檸檬酸氫二氨2.0 g，硫酸鎂0.58 g，K2HPO4·3H2O 2.0 g，蒸餾水1 L，固體培養基含瓊脂2.0%，pH 5.8，121℃滅菌15 min。

1.1.3 主要儀器設備

MJ-54A/MJ-78A型STIK滅菌鍋：北京天賜科儀商貿有限公司；Microfuge16型離心機：美國貝克曼公司；110-801型三量ip67防水原點數顯卡尺不銹鋼零點電子游標尺：東莞市景有模具五金有限公司；DHP-600恒溫培養箱：常州中捷實驗儀器制造有限公司；9700 PCR儀：美國Applied Biosystems公司；DYY-10C型電泳儀及DYCZ-28A型電泳槽：北京市六一儀器廠；1708195型凝膠成像系統：伯樂（Bio-Rad）公司。

1.2 方法

1.2.1 培養及優化前發酵方法

指示菌的培養方法：挑取鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028接種于裝有100 mL營養肉湯培養基的250 mL錐形瓶中，37℃培養至對數生長期（約107cfu/mL）。

乳酸菌的培養方法：挑取菌株接種于裝有100 mL MRS培養基（pH 5.8）的250 mL錐形瓶中，37℃培養至對數生長期（約109cfu/mL），菌液備用。

優化前發酵方法：將乳酸菌菌液按1%接種于裝有100 mL MRS培養基（p H 5.8）的250 mL錐形瓶中，37℃發酵24 h。

1.2.2 抑菌活性的測定

發酵上清液制備：發酵液經12 000×g，于4℃離心10 min，收集上清液，用1 mol/L NaOH調p H值至7.0，排除有機酸的干擾。加入過氧化氫酶（終濃度為5.0 mg/mL），37℃水浴2 h排除過氧化氫的干擾，上清液經0.22μm濾膜過濾后備用，取50μL上清液測定抑菌活性。抑菌活性采用雙層平板打孔法檢測[11]，打孔直徑為6 mm，抑菌圈直徑采用電子游標卡尺測定。

1.2.3 產細菌素乳酸菌的篩選及鑒定

1.2.3.1 菌種的分離及篩選

將25 mL供試樣品放入225 mL無菌生理鹽水中，將菌液進行10倍的梯度稀釋，取10-3、10-4、10-5分別吸取100μL菌液涂布于MRS和M 17平板上，37℃培養48 h～72 h，分離出革蘭氏染色陽性、過氧化氫酶試驗陰性的乳酸菌菌株，經反復純化后保藏。挑取菌株按1.2.1方法培養發酵測定抑菌活性，抑菌圈直徑最大的菌株用于進一步研究。

1.2.3.2 產細菌素乳酸菌菌株的鑒定

通過菌落形態、菌體形態、生理生化鑒定和16SrDNA基因序列測定完成菌株的鑒定。觀察分離菌株在固體MRS培養基上的菌落形態、革蘭氏染色后的菌體形態及生理生化鑒定結果，根據《常見細菌系統鑒定手冊》及《伯杰氏細菌鑒定手冊》（第八版）進行菌株的初步鑒定。

應用細菌基因組提取試劑盒進行菌體DNA的提取，通過PCR擴增16SrDNA基因序列進一步鑒定菌株。根據GenBank中已公布的植物乳桿菌的16SrDNA基因序列（序列號分別為KC429782.1、NR_115605.1、NR_113338.1、NR_104573.1、NR_042394.1）設計引物，上游引物為（MXG-68-F）：5'-GACGAACGCTGSCGGCGTGCCTAAT-3'，下游引物為（MXG-68-R）：5'-GGTGATCCAAC CGCAGGTT CTCCTA-3'。PCR擴增產物通過1%瓊脂糖凝膠電泳（100 V）檢測，送上海生工生物工程技術有限公司進行序列測定。利用NCBI中的Blast（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST），將所測定的序列與數據庫中的序列進行比對，應用neighbour-joining method構建系統進化樹。

1.2.3.3 菌株MXG-68產抑菌物質的水解酶敏感性試驗

發酵上清液中分別加入胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶κ、α-淀粉酶、脂肪酶，終濃度為1 mg/mL，37℃處理2 h，對照為37℃處理2 h的發酵上清液。抑菌活性按1.2.2方法測定。

1.2.4 細菌素發酵條件的單因素試驗

1.2.4.1 溫度的影響

將菌株MXG-68的菌液按1%接種于裝有100 mL MRS培養基（pH 5.8）的250 mL錐形瓶中，分別于25、30、35、40、45℃培養24 h，抑菌活性按1.2.2方法測定[12]。

1.2.4.2 初始p H的影響

將菌株MXG-68的菌液按1%接種于裝有100 mL初始pH分別為4、5、6、7、8的MRS培養基的250 mL錐形瓶中，37℃培養24 h，抑菌活性按1.2.2方法測定[13]。

1.2.4.3 抗壞血酸的影響

將菌株MXG-68的菌液按1%接種于裝有100 mL分別添加1μg/mL、2μg/mL、3μg/mL、4μg/mL、5μg/mL抗壞血酸的MRS培養基（p H 5.8）的250 mL錐形瓶中，37℃培養24 h，抑菌活性按1.2.2方法測定[9]。

1.2.4.4 EDTA的影響

將菌株MXG-68的菌液按1%接種于裝有100 mL分別添加3 mg/mL、4 mg/mL、5 mg/mL、6 mg/mL、7 mg/mL抗壞血酸的MRS培養基（p H 5.8）的250 mL錐形瓶中，37℃培養24 h，抑菌活性按1.2.2方法測定[14]。

1.2.5 響應面法優化細菌素發酵條件

應用Design-Expert軟件中的Box-Benhnken設計構建模型，響應面法尋找細菌素最佳發酵條件。以溫度（A）、初始pH（B）、抗壞血酸（C）、EDTA（D）四個因素為自變量，抑菌圈直徑（mm）為響應值，運用四因素三水平的響應面分析試驗，共29個試驗點，其中24個為析因子，5個為中心試驗。試驗因素水平見表1。

表1 響應面因素水平

1.2.6 數據分析

抑菌圈直徑的測定數據均重復三次，應用SPSS 17.0軟件中的One-way analysisof variance（ANOVA）計算標準差。采用Design-Expert 8.0.6軟件中Box-Benhnken設計進行響應面數據分析。

2 結果與分析

2.1 菌株的篩選與鑒定

2.1.1 菌株的分離及篩選

應用MRS和M 17平板從供試樣品酸馬奶中分離出86株革蘭氏染色陽性、過氧化氫酶陰性的乳酸菌菌株，應用雙層平板打孔法篩選出41株具有鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028抑菌活性的菌株，其中菌株MXG-68抑菌活性顯著高于其他菌株（P＜0.01），抑菌圈直徑達到14.63±0.19 mm（見圖1），將菌株MXG-68應用于進一步的研究。

圖1 乳酸菌發酵上清液對鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028的抑菌圈

2.1.2 菌落形態、菌體形態及生理生化鑒定

由表2和表3中的結果顯示，革蘭氏染色陽性，短桿狀，過氧化氫酶、硝酸鹽還原試驗、明膠液化試驗、吲哚試驗、H 2S試驗陰性，無運動性，pH 4.5能生長，根據《伯杰氏細菌鑒定手冊》（第八版）及《常見細菌系統鑒定手冊》可確定菌株MXG-68屬于乳桿菌屬。依據糖發酵實驗結果，可初步確定菌株MXG-68為植物乳桿菌。

表2 菌株MXG-68的菌落形態和菌體形態

表3 菌株MXG-68的生理生化特征

2.1.3 菌株MXG-68的16S rDNA基因序列分析

以菌株MXG-68的總基因組DNA為模板，應用引物MXG-68-F和MXG-68-R擴增16S rDNA基因片段，獲得的序列片段長度為1 534 bp（見圖2），其序列與GenBank中已公布的植物乳桿菌的16SrDNA基因序列同源性高達99%以上，進一步證明菌株MXG-68為植物乳桿菌，其16SrDNA基因序列已提交到GenBank，序列號為KY750314。

系統進化樹結果顯示菌株MXG-68與植物乳桿菌JCM 1149（NR_115605.1）、植物乳桿菌NBRC15891（NR_113338.1）、植物乳桿菌CIP103151（NR_104573.1）、植物乳桿菌NRRLB-14768（NR_042394.1）的16SrDNA基因序列同在一個進化分支上（見圖3），菌株MXG-68與同一分支上基因序列同源性高達99.47%～99.93%，而與不同分支上基因序列的同源性相對較低，可進一步確定菌株MXG-68為植物乳桿菌。

圖2 瓊脂糖凝膠電泳鑒定菌株MXG-68的16SrDNA基因

圖3 植物乳桿菌MXG-68的16SrDNA基因與同源序列構建的系統進化樹

2.1.4 植物乳桿菌MXG-68所產抑菌物質的水解酶敏感試驗結果

由表4可知，胃蛋白酶和胰蛋白酶導致抑菌活性完全喪失，糜蛋白酶、木瓜蛋白酶和蛋白酶K處理的發酵上清液抑菌活性顯著降低（P＜0.01），而α-淀粉酶和脂肪酶對抗菌活性基本無影響（P＞0.05），結果表明植物乳桿菌MXG-68所產抑菌物質是一類蛋白類（多肽）物質。細菌素為一類由細菌核糖體合成的抗菌蛋白類物質，植物乳桿菌MXG-68所產抑菌物質在排除酸及過氧化氫的影響后，經多種水解酶處理證實其蛋白性質，由此可確定此抑菌物質是一種細菌素。

2.2 細菌素發酵條件的單因素試驗結果

2.2.1 溫度對細菌素合成的影響

由圖4可知，溫度為30℃時，抑菌活性最高，抑菌圈直徑可達18.01±0.36 mm。與Ogunbanwo、Lim、陳蕓蕓等的研究結果一致，30℃有利于植物乳桿菌細菌素的合成。發酵溫度過低會導致菌體生長緩慢和各種反應速率低，溫度過高導致反應速率加快，菌體易衰老，發酵周期短，影響細菌素的最終產量。溫度除了直接影響發酵過程中各種反應速率外，還影響基質和氧在發酵液的溶氧和傳遞速率及某些基質的分解吸收速度、生物合成方向等[9,15,16]。

表4 水解酶對抑菌活性的影響

圖4 溫度對植物乳桿菌MXG-68產細菌素的影響

2.2.2 初始p H對細菌素合成的影響

由圖5可知，初始pH為7.0時，抑菌活性最高，抑菌圈直徑可達17.18±0.24 mm。p H值影響發酵液及代謝產物的物理化學性質，初始p H過低或過高均不利于菌體的生長及細菌素的合成，特別是細菌素的穩定性，H+或OH-可能會導致細菌素的結構和活力變化，因此，初始pH為近中性有利于細菌素的合成。

圖5 初始pH對植物乳桿菌MXG-68產細菌素的影響

2.2.3 抗壞血酸對細菌素合成的影響

由圖6可知，抗壞血酸的添加量為2μg/mL時，抑菌活性最高，抑菌圈直徑可達18.76±0.19 mm?？箟难釢舛冗^高或過低不利于細菌素的合成量，可能是由于抗壞血酸作為一種還原性物質，會影響發酵液的氧化還原電勢。與Lim的研究結果相一致，抗壞血酸可提高植物乳桿菌MXG-68和植物乳桿菌KC21的細菌素合成量[9]。

2.2.4 EDTA對細菌素合成的影響

圖6 抗壞血酸對植物乳桿菌MXG-68產細菌素的影響

圖7 EDTA對植物乳桿菌MXG-68產細菌素的影響

由圖7可知，EDTA的添加量為5 mg/mL時，抑菌活性最高，抑菌圈直徑可達18.23±0.11 mm。結果顯示EDTA有利于增強植物乳桿菌MXG-68所產細菌素對鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028的抑菌活性，與Gong、Castellano等的研究結果相一致。EDTA可通過釋放脂多糖及螯合二價陽離子而穿透革蘭氏陰性菌的外膜，有利于細菌素到達細胞膜，增強細菌素的抑菌活性[14,17]。

2.3 響應面法優化細菌素的發酵條件

2.3.1 模型建立及顯著性分析

以抑菌圈直徑為響應值，運用Box-Benhnken設計29組實驗（見表5）。二次回歸模型為：Y=-107.64300+2.49927×A+17.50433×B+4.07267×C+10.60667×D+5.50000×10-3×A×B-1.05471×10-16×A×C+5.00000×10-4×A×D-2.50000×10-3×B×C-2.20657×10-15×B×D-0.012500×C×D-0.042227×A2-1.27317×B2-1.04567×C2-1.04817×D2。Y為抑菌圈直徑的預測值，A為溫度的編碼值，B為初始pH的編碼值，C為抗壞血酸的編碼值，D為EDTA的編碼值。

由表6可知，該模型的P＜0.01，表明試驗所采取的二次模型極顯著。失擬項的P=0.1040＞0.05，模型失擬項不顯著，決定系數R2=0.9997，表明模型與實際情況擬合度較高，所以可應用該模型對植物乳桿菌MXG-68的細菌素合成進行預測和分析。該模型中A、B、C、D、A2、B2、C2、D2的P＜0.01，表明溫度、初始p H、抗壞血酸、EDTA、溫度的平方、初始p H的平方、抗壞血酸的平方、EDTA的平方對細菌素合成量的影響極顯著。AB的P＜0.05，表明溫度和初始p H的交互作用對細菌素合成量的影響顯著。交互項AC、AD、BC、BD、CD的P＞0.05，說明這些交互作用對細菌素合成量無顯著性影響。

表5 Box-Benhnken試驗設計及結果

2.3.2 響應面分析

各因素的變化范圍分別為溫度（25～35℃），初始pH（6～8），抗壞血酸（1μg/mL～3μg/mL），EDTA（4～6 mg/mL）。在分別分析兩個因素之間的交互作用時，其中一個因素固定，隨著另一個因素濃度的增加，細菌素的合成量均呈現先增加后減少的趨勢。優化發酵條件為溫度30.08℃、初始pH 6.94、抗壞血酸1.91μg/mL、EDTA 5.06 mg/mL。預測的抑菌圈直徑為21.36 mm（見圖8）。

圖8 優化發酵條件下的3D響應面圖

2.3.3 回歸模型的驗證試驗

為檢驗預測結果的可靠性，采用發酵條件進行驗證試驗。實際溶圈直徑為21.42±0.16 mm，與預測的溶圈直徑21.36 mm相比較差異不顯著（P＞0.05），表明該模型可靠性好。與優化前的溶圈直徑14.63±0.19 mm相比較，溶圈直徑提高了46.41%，可見該模型能較好地預測細菌素的合成情況。

表6 二次模型的方差分析

3 結 論

菌株16S rDNA基因具有高保守性，利用軟件Primer5.0設計引物，通過PCR技術建立基于16SrDNA序列的生物分類方法，結合菌株的基礎鑒定方法能夠更準確地完成菌株的鑒定。本研究結合菌落形態、菌體形態、生理生化鑒定、16SrDNA基因同源性比對及系統進化樹構建結果準確鑒定了菌株MXG-68為植物乳桿菌。細菌素是某些細菌在代謝過程中通過核糖體合成機制產生的一類具有生物活性的前體多肽、多肽或蛋白質[18-20]，因此結合水解酶敏感性試驗結果可進一步確定其為產細菌素菌株。

應用響應面法綜合分析發酵條件對植物乳桿菌MXG-68合成細菌素的影響，優化發酵條件為溫度30.08℃、初始p H 6.94、抗壞血酸1.91μg/mL、EDTA 5.06 mg/mL。優化發酵條件下抑菌圈直徑可高達21.42 mm，與響應面預測值（21.36 mm）相比差異不顯著，表明構建二次模型的科學性和準確性，有利于乳酸菌細菌素作為新型生物防腐劑的應用，為實現工業化生產奠定基礎。