SPE-HPLC分析運動型乳飲料中多種人工合成色素

陳杰

（鄭州大學體育學院，鄭州 450044）

0 引 言

運動型乳飲料是一類富含蛋白質和多肽類物質，可以改善人體疲勞，減少運動后的肌肉損失，幫助運動者的肌肉增長，補充其身體營養素的運動飲品[1]。近些年來運動飲品市場的火爆，帶動了運動型乳飲料的銷售商機，商家為其具有可觀的銷售，冠以各種口味和顏色的運動型乳飲料，這其中避免不了會添加各種色素，起到調整產品的色澤、增強食欲的作用[2]。食用色素分為天然色素和人工合成色素，現在企業一般都會添加人工合成色素來降低產品成本。人工合成色素又稱著色劑，大多是以苯、甲苯、萘等經過磺化、硝化等反應合成。由于人工合成色素在人體內有積蓄性，過多的攝入會對身體健康產生影響[3-5]。而運動型乳飲料針對的人群比較特殊，所以更需要對這類產品中人工合成色素的使用情況進行檢測和監控，在我國標準中也規定了人工合成色素（著色劑）允許使用的最大值[6-7]。

在研究運動型乳飲料的文獻中，研究其營養性、抗疲勞性的較多，但與之相關的人工合成色素的檢測研究較少。人工合成色素的檢測方法中，主要為高效液相色譜法（High performance liquid chromatography，HPLC）[8-10]。現行國家標準中[11]，樣品前處理一般采用聚酰胺吸附法或者液-液分配法，方法操作較繁瑣，樣品的加標回收率較低。本實驗針對運動型乳飲料常添加的幾種人工合成色素，對標準中前處理方法進行了一些相應改變和優化，建立一種同時檢測運動型乳飲料中6種人工合成色素（檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍）的固相萃取-高效液相色譜法（Solid phase extraction high performance liquid chromatography，SPE-HPLC），可應用于運動型乳飲料中人工合成色素的檢測，方法快速、簡便，測定結果穩定準確，具有實用價值。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜，美國Waters 2695型；二極管陣列檢測器，美國Waters2998型。

檸檬黃（純度99.9%），莧菜紅（純度99.9%）、胭脂紅（純度99.9%），日落黃（純度99.9%），誘惑紅（純度99.8%），亮藍（純度99.6%），上海安譜科學儀器有限公司。

1.2 色譜條件

色譜柱：Sunfire C18(5.0 mm×150 mm,5μm)；流動相：乙腈-KH2PO4（20 mmol/L）（55∶45，v/v）；流速，0.6 mL/min；進樣量，20μL；柱溫，30℃。

1.3 實驗方法

1.3.1 色譜條件的優化

本實驗中涉及到6種目標物的色譜分析，不同的流動相pH值、流速以及柱溫都會對各目標物的保留時間和分離度產生影響；各個目標物的最大吸收波長也不相同，需進行全波長掃描后進行選擇合適波長進行檢測，因此本實驗對以上各個參數進行優化。

1.3.2 前處理方法的優化

常用于液態樣品提取溶劑的有甲醇、乙醚、磷酸、偏磷酸、乙醇等，鑒于甲醇、乙醚具有一定的毒性，而用磷酸、偏磷酸提取運動型乳飲料時會因提取液中酸根陰離子的存在而影響人工合成色素的分離測定，因而綜合考慮選擇乙醇作為提取劑，并對提取的條件進行方法優化處理；在固相萃取柱的條件優化方面，分別比較不同的淋洗液和洗脫液對目標物平均回收率的影響。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的優化

2.1.1 流動相體系p H值的選擇

以乙腈-KH2PO4（20 mmol/L）（55∶45，v/v）為流動相，以磷酸來調節流動相體系的pH值，比較2.1、2.3、2.5、2.7、2.9等5個不同p H值的流動相體系對6種人工合成色素組分保留時間和分離度的影響，結果見圖1。

圖1 流動相pH值對人工合成色素保留時間的影響

由圖1可知，從保留時間上看，隨著流動相p H值的增大，檸檬黃、日落黃、誘惑紅和亮藍等4種組分的保留時間縮短，而莧菜紅、胭脂紅的保留時間基本不受流動相pH值的影響。從分離度上看，隨著流動相p H值增加，莧菜紅、胭脂紅、日落黃等3種組分的分離度變差。綜合考慮保留時間和分離度，選擇p H 2.5作為流動相體系的pH值。

2.1.2 流速的選擇

設定柱溫30℃，以乙腈-KH2PO4（20 mmol/L）（55∶45，v/v）為流動相為流動相，分別比較流動相流速為0.5，0.6，0.7，0.8，1.0 mL/min時，對6種人工合成色素組分保留時間和分離度的影響，結果見圖2。

圖2 流速對人工合成色素保留時間的影響

由圖2可知，隨著流速的增大，目標組分的保留時間提前，但是分離程度卻越來越差，特別是當流速為1.0 mL/min時，莧菜紅、胭脂紅、日落黃3種人工合成色素的峰幾乎出現重疊，嚴重影響了分離效果。綜合考慮，選擇0.6 mL/min的流速，此時6種人工合成色素組分保留時間和分離度都比較理想。

2.1.3 柱溫的選擇

以乙腈-KH2PO4（20 mmol/L）（55∶45，v/v）為流動相為流動相，流速為0.6 mL/min，分別在25，30，35，40，45℃等5個柱溫條件下，分析對6種人工合成色素組分保留時間和分離度的影響，結果見圖3。

圖3 柱溫對人工合成色素保留時間的影響

由圖3可知，隨著柱溫的升高，目標組分的保留時間均有所提前，除胭脂紅的分離度基本不變外，其余各組分酸的分離度均越來越低。綜合考慮保留時間和分離度的影響，選擇30℃作為分析時儀器的柱溫。

2.1.4 檢測波長的選擇

本實驗檢測器采用二極管陣列檢測器檢測，在檢測波長200～600 nm范圍內對6種人工合成色素的標準溶液進行全波長掃描，根據各個組分的全波長掃描選擇最大的吸收波長，全波長掃描圖如圖4所示。

由圖4可知，6種人工合成色素主要在波長210 nm、245 nm以及500 nm左右處有較大吸收，由于在210 nm處背景吸收較強，干擾物質多，暫不考慮此波長；所以實驗比較245 nm、500 nm兩處的樣品檢測分離情況，結果如圖5所示。

圖4 6種合成人工合成色素的全波長掃描圖

由圖5可知，莧菜紅、胭脂紅的目標峰在500 nm的波長下，背景干擾小，基線較平穩，較適合分析定量，所以實驗選擇500 nm作為檢測波長。

2.2 標準曲線的制作

實驗結果如表1所示，6種目標組分在1.0～50.0μg/mL內均具有良好的線性關系，其中莧菜紅、胭脂紅、日落黃的檢出限為0.20 mg/kg，定量限為0.60 mg/kg；檸檬黃、誘惑紅和亮藍的檢出限為0.30 mg/kg，定量限為1.0 mg/kg，結果見表1所示。

濃度為2.0μg/mL的6種人工合成色素混標分析色譜圖如圖6所示。

2.3 前處理方法的優化

2.3.1 不同濃度乙醇溶液提取效果

以運動型乳飲料為實驗對象并添加6種組分，對不同濃度的乙醇溶液做提取劑進行試驗。圖7為乙醇濃度分別為5%、10%、20%、30%、40%、50%做提取劑時各人工合成色素組分含量的測定結果。

由圖7可知，以莧菜紅為例，隨著乙醇濃度的增加，提取液中莧菜紅檢測含量呈現先增加后下降的趨勢，在以10%乙醇作為提取溶液時，莧菜紅的含量能達到5.8 mg/100 mL，而以20%乙醇溶液和30%乙醇溶液提取時莧菜紅含量分別降低了10.3%和15.5%，以40%乙醇溶液和50%乙醇溶液提取時莧菜紅含量分別降低了34.4%和60.3%。樣品中其他5種組分含量變化也類似，也表現為用10%乙醇溶液提取時含量最高，其他濃度的乙醇溶液為提取劑時，組分含量分別有不同程度的降幅。

2.3.2 淋洗液與洗脫液的選擇

樣品提取液進入固相萃取柱后要進行淋洗和洗脫步驟，淋洗液與洗脫液的選擇也會影響到目標物的測定值。本實驗主要對4種淋洗液以及3種洗脫液進行比較，實驗結果如圖8所示。

表1 6種組分的保留時間、標準曲線、相關系數、檢出限與定量限

由圖8可知，淋洗液選擇甲酸-水溶液的效果最好，在酸性的水溶液環境下，色素更易保留在固相萃取柱上；而甲酸相對色素而言，對樣品提取液中的干擾物有更強的洗脫力。在洗脫液選擇方面，氨化甲醇的洗脫效果最好，這是由于堿性環境下的有機溶劑，更易使色素與固相萃取柱分離。

2.4 加標回收率與精密度

以已知人工合成色素含量的運動型乳飲料為基質，分別添加1.0、10.0、50.0 mg/kg等3個梯度濃度的人工合成色素標準混合溶液，進行加標回收試驗，每個濃度重復測定5次，測定結果見表2。

由表2可見，6種組分的3個水平的加標回收率為90.5%～95.7%，相對標準偏差范圍為2.3%～4.6%，表明本實驗所建立的方法能夠滿足檢測實際樣品需要。

圖5 運動型乳飲料中莧菜紅、胭脂紅分別在254 nm波長、500 nm波長下的色譜圖

圖6 6種合成人工合成色素的色譜圖

圖7 人工合成色素組分含量隨提取劑配比變化情況

圖8 淋洗液、洗脫液的選擇對色素含量的影響

表2 方法的回收率及相對標準偏差(n=5)

表3 樣品中6種人工合成色素的測定(n=5)

2.5 實際樣品測定

在市場上抽取5種不同品牌口味并標稱含有人工合成色素的運動型乳飲料，檢測結果見表3。

結果如表3所示，可以看出不同品牌口味的運動型乳飲料中含有的人工合成色素的種類和含量差異較大，5款飲品中都含有人工合成色素，檢測到的種類與產品外包裝標簽中標出的一致，也與樣品的顏色整體相符，所檢結果也未超過標準所規定值，整體情況良好。

3 結 論

本實驗建立了一種固相萃取-高效液相色譜同時檢測運動型乳飲料中6種人工合成色素的分析方法，根據流動相pH值、流速以及柱溫對6種組分分離度有較大影響的特點，在最大吸收波長下進行信號收集，并結合人工合成色素在固相萃取柱上的保留特性，優化了分析條件和前處理方法，最大程度避免了雜質干擾，提高目標物的檢驗靈敏度。結果表明，采用乙腈-KH2PO4（20 mmol/L）（55∶45，v/v）（pH 2.5）為流動相，流速為0.6 mL/min，柱溫為30℃，檢測波長為500 nm的條件下，6種目標組分能在1.0～50.0μg/mL內均具有良好的線性關系，檢出限范圍為0.20～0.30 mg/kg，定量限范圍為0.60～1.0 mg/kg。樣品前處理由10%乙醇提取后，選擇甲酸-水溶液作為固相萃取淋洗液，氨化甲醇為洗脫液，加標回收率能達到90.5%～95.7%，相對標準偏差范圍為2.3%～4.6%，所建立的方法具有可靠的準確度和精密度，能準確快速有效地檢測運動型乳飲料中的6種人工合成色素的含量，可為運動型乳飲料中多種人工合成色素的分析和監控提供技術支持。