嬰幼兒配方食品中乳鐵蛋白含量測定方法比較研究

李莉，李碩，董亞蕾，劉釗，王海燕，丁宏

（中國食品藥品檢定研究院，北京 100050）

0 引 言

乳鐵蛋白(Lactoferrin，簡稱LF)是一種非血紅素鐵結合糖蛋白，是從乳汁中提取的一種天然物質。人初乳中乳鐵蛋白質量濃度為5～7 g/L，常乳中為1～3 g/L。牛乳中乳鐵蛋白質量濃度較母乳低，牛初乳為0.8 g/L左右，牛常乳中為0.1～0.4 g/L[1]。乳鐵蛋白具有廣譜抗菌性，調節體內鐵平衡，抑制腫瘤細胞生長等生物活性[2]，是母乳中對嬰幼兒免疫功能非常重要的一種營養物質。我國食品安全國家標準《食品營養強化劑使用標準》GB14880-2012中將其列為營養強化劑，允許在嬰幼兒配方食品中使用[3]。國外嬰兒配方奶粉中乳鐵蛋白的添加量基本在0.5 g/kg左右[4]，按照GB14880-2012規定，嬰幼兒配方食品中乳鐵蛋白允許添加量≤1.0 g/kg。

目前市場上的嬰幼兒配方食品質量參差不齊，由于乳鐵蛋白價格昂貴，不乏有不良生產者生產的食品中乳鐵蛋白實際添加量低于標簽標示水平的情形[5]。但由于我國尚未發布食品中乳鐵蛋白含量測定的食品安全國家標準，對于市售聲稱添加乳鐵蛋白的嬰幼兒配方食品中是否含有乳鐵蛋白，以及含量是否符合標簽標示范圍，不僅是消費者關心的問題，更是食品安全監管人員為形成有力監管亟待解決的技術瓶頸。目前，國內外文獻中乳鐵蛋白的主要檢測方法有高效液相色譜法[6-11]、高效液相色譜串聯質譜法[12]、毛細管電泳法[12]、分光光度法[13-14]、酶聯免疫吸附法[15-19]等，我國目前尚未出臺嬰幼兒配方食品中乳鐵蛋白檢測食品安全國家標準，檢測方法的空白依然是限制乳鐵蛋白應用及深入研究的主要技術瓶頸。本研究擬通過兩種不同原理的檢測方法：乳鐵蛋白酶聯免疫檢測試劑盒法和高效液相色譜法對嬰幼兒配方食品中乳鐵蛋白含量進行測定，并對檢測結果對比分析，探討常用檢測方法的差異以及優缺點，以期對相關檢測和研究人員在選擇嬰幼兒配方食品中乳鐵蛋白檢測方法時提供技術參考和數據支持。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Synergy HT酶標儀（美國伯騰公司）；Waters e2695型高效液相色譜儀，配有2998型二極管陣列檢測器（美國Waters公司）；AL 204型分析天平（瑞士Metter Toledo公司）；XP 205型分析天平（瑞士Metter Toledo公司）；G2型渦旋振蕩器（美國Scientific Industries公司）；KQ-3200DE型超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。乳鐵蛋白酶聯免疫檢測試劑盒（德國拜發公司）；乳鐵蛋白標準品（美國Sigma公司，純度85.0%）；乙腈（色譜純，德國Meker公司）；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；三氟乙酸（純度＞99%，比利時ACROS公司）；乳鐵蛋白肝素免疫親和柱（美國GE公司）；嬰兒食品樣品由澳優公司、貝因美公司和貝登公司提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 酶聯免疫試劑盒檢測法

1.2.1.1 樣品制備

首先將試劑盒中的10倍濃縮稀釋緩沖液，用超純水稀釋10倍待用。準確稱取樣品4.00 g用4℃超純水溶解，轉移至100 mL容量瓶中定容，充分混勻。然后根據樣品含量用稀釋液進行相應倍數的稀釋。

1.2.1.2 試劑盒檢測方法的建立

首先將試劑盒中的20倍濃縮洗滌緩沖液，用超純水稀釋20倍待用。取出所需數量的微孔條置于微孔架上，吸取50μL各個濃度的標準品溶液和稀釋后的樣品溶液，分別加入微孔板中，每個標準品和樣品設置復孔，然后向每個微孔中加入25μL酶連接物，最后向每個微孔中加入25μL抗體，混勻后25℃培養箱避光孵育60 min；孵育結束后洗板3次，加入100μL底物，25℃孵育30 min；孵育結束后加入100μL終止液，使用酶標儀讀取450 nm波長處的吸光值，使用計算軟件建立乳鐵蛋白標準曲線并計算樣品中乳鐵蛋白含量。

1.2.1.3 試劑盒檢測法的準確性驗證

選取不含乳鐵蛋白的嬰兒乳粉作為添加回收空白樣品，向其中添加乳鐵蛋白標準品儲備液，添加濃度分別為50 mg/100 g和100 mg/100 g，每個濃度水平平行制備5份，按照試劑盒方法進行檢測。

1.2.2 高效液相色譜法

1.2.2.1 標準溶液制備

乳鐵蛋白標準儲備溶液（10 mg/mL）：準確稱取0.25 g乳鐵蛋白標準品（精確至0.1 mg）用水溶解，定容至25 mL，混勻。

乳鐵蛋白標準中間溶液（1.0 mg/mL）：準確吸取5.0 mL乳鐵蛋白標準儲備溶液至50 mL容量瓶中，用水定容至刻度。

標準系列工作溶液：分別準確吸取乳鐵蛋白標準中間溶液0.2 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、4.0 mL至10 mL容量瓶中，用水定容至刻度，得到濃度依次為20μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL標準系列工作溶液。將標準系列工作溶液過0.45μm濾膜后供液相色譜分析。

1.2.2.2 樣品制備

稱取約1 g（精確至0.1 mg）樣品，置于50 mL離心管中，加入10 mL磷酸氫二鈉溶液，渦旋0.5 min，使樣品溶解并混合均勻。超聲15 min后，4℃下以10 000 r/min轉速離心10 min。將上清液用定量濾紙過濾到燒杯中，再加入10 mL磷酸氫二鈉溶液重復操作提取一次，合并兩次液體作為提取液備用。肝素親和柱使用前加入5 mL磷酸氫二鈉溶液平衡，然后加入上述樣品提取液，待樣品完全流出后，再用10 mL磷酸氫二鈉溶液淋洗，棄去全部流出液。最后用4.5 mL磷酸氫二鈉-氯化鈉溶液洗脫，收集全部流出液，用磷酸氫二鈉-氯化鈉定容至5 mL。將收集溶液過0.45μm濾膜后供液相色譜分析。

1.2.2.3 液相色譜法的準確性驗證

選取不含乳鐵蛋白的嬰兒乳粉作為添加回收空白樣品，向其中添加乳鐵蛋白標準品儲備液，添加濃度分別為50 mg/100 g和100 mg/100 g，每個濃度水平平行制備5份，以下按1.2.2.2步驟進行處理。

1.2.3 色譜條件

色譜柱：CNW C4型色譜柱(300?（孔徑），250 mm×4.6 mm（內徑），5μm)，流動相A為乙腈，流動相B為0.1%三氟乙酸溶液，梯度洗脫，洗脫時間15 min，流速1.0 mL/min，檢測波長280 nm，進樣量50μL。

2 結果與分析

2.1 準確度和精密度試驗結果

選取不含乳鐵蛋白的嬰兒乳粉作為添加回收空白樣品，向其中添加乳鐵蛋白標準品儲備液，采用不同方法進行分析測定，每種濃度測定5次，結果見表1。由表1可見，兩種方法回收率測定結果均滿足方法學要求，回收率在80.5%～96.0%之間，相對標準偏差均低于10%。通過對比兩種方法的加標回收情況可以看出，試劑盒法測定結果的相對標準偏差雖然滿足方法學的要求，但相對液相色譜法來說RSD值仍明顯偏大，說明試劑盒檢測法的重復性稍差。

表1 準確度和精密度試驗結果

2.2 實際樣品測定結果

采用試劑盒法和液相色譜法分別測定了7批嬰幼兒配方乳粉和1批特殊醫學用途嬰兒配方食品中的乳鐵蛋白含量，每批樣品測定2個平行樣，檢測結果見表2。試驗結果表明，高效液相色譜法的測定結果整體而言略低于酶聯免疫試劑盒法的測定結果，這可能是由于液相色譜法中樣品前處理步驟比較繁瑣，用乳鐵蛋白肝素免疫親和柱凈化時需要手動過柱，回收率不高造成的。

采用EXCEL軟件對兩種方法的測定結果進行了方差分析。通過F檢驗（結果見表3）得出兩者的精密度沒有顯著性差異之后，再進行t檢驗，結果見表4，雙尾t檢驗的顯著性概率P=0.946(＞0.05)，表明兩種方法間不存在顯著性差異。

表2 不同方法的測定結果

表3 F檢驗結果

表4 t檢驗結果

2.3 兩種分析測定方法對比

酶聯免疫試劑盒法靈敏度高，特異性強，操作較為簡便，結果容易觀察，而且能夠同時對大樣本量進行檢測，但容易受到試劑盒品牌、實驗人員的操作經驗和熟練程度等因素的影響，方法重復性稍差。由于嬰兒配方食品中添加的乳鐵蛋白量差異較大，用試劑盒法檢測時應將樣品稀釋成合適的濃度，使得測定結果在線性范圍的中間位置。此外，由于嬰兒配方食品含有的營養素較多，不同廠家或品牌的配方差異大、干擾因素較多，為減少誤差，每次檢測時最好隨行質控樣品或進行回收試驗。高效液相色譜法測定的結果準確，實驗再現性良好，但是目前常用的前處理方法是利用肝素親和柱凈化法，雖然能對樣品較好的分離和純化，但操作步驟繁瑣，手動上樣費時費力。此外，肝素親和柱價格昂貴，且重復利用次數較少，樣品前處理依然是限制液相色譜法成為乳鐵蛋白首選檢測方法的關鍵因素。

3 結 論

經對兩種分析方法的比較研究，結果表明該兩種方法的測定結果無顯著性差異，均可用于嬰幼兒食品中乳鐵蛋白的測定，實際檢測工作中可以基于不同檢測需求選用最適宜的分析方法。