不同尺度魚油脂質體對酸奶品質的影響

何玉寧，王錫昌，陶寧萍，鐘建

（上海海洋大學食品學院農業部水產品加工副產物綜合利用技術集成科研基地上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海 210306）

0 引 言

魚油中含有大量的水產品特征活性物質n-3多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFAs），其中DHA和EPA是兩種典型的PUFAs，是大腦和視網膜細胞膜的重要組成成分[1]，對人體的健康起著極其重要的作用，具有抗炎抗腫瘤[2]、增強機體抗氧化能力[3]、促進智力視力發育[4]、預防心血管疾病[5]和老年癡呆癥[6]等作用；它們極易氧化和酸敗，并具有難聞的魚腥味，其在食品工業中的應用受到了一定限制[7-8]。脂質體技術作為一種包埋方式因其所用組分脂質與細胞膜近似且能夠有效提高DHA和EPA的水溶性以及在人體中的消化吸收率[9]而受到國內外的廣泛關注，在營養健康食品工業中具有較大的應用潛力。Tahere[8]等于2017年使用加熱結合均質的方法制備出魚油納米脂質體添加于酸奶中，發現其冷藏21天后的DHA/EPA含量高于添加有未包封的魚油酸奶組；而此方法耗能較多，且加熱易破壞脂質體的結構，導致魚油的氧化。前人對載n-3 PUFAs的研究多使用氯仿/甲醇作為制備過程中的溶劑[10-12]，此溶劑可能帶來較多的毒性和污染。本實驗通過擠出法，采用大豆磷脂作為壁材，使用乙醇作為溶劑制備魚油脂質體，并通過不同孔徑聚碳酸酯膜對其尺度進行調控，并將其應用于酸奶的制備中，評價了其對酸奶品質的影響，實現了水產資源的高值化利用，為進一步n-3 PUFAs營養補充乳制品的開發具有一定指導性作用。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

DHA和EPA標品均購于美國Sigma公司；無水乙醇、正己烷、甲醇、鄰苯二甲酸氫鉀、無水磷酸氫二鈉和無水磷酸二氫鉀均購于中國國藥集團；魚油（EPA+DHA 70%）購買于西安綠騰生物科技有限公司；大豆磷脂（卵磷脂含量60%）購自天津鶴喜園磷脂科技有限公司；聚碳酸酯膜（100 nm,400 nm,1 000 nm）購自北京希凱生物技術有限公司；酸奶發酵劑購于安琪酵母股份有限公司；脫脂乳粉購買于紐瑞滋食品有限公司。

1.1.2 儀器設備

Avanti脂質體擠出儀購于美國Avanti Polar Lipids公司；LAUDA Ecoline電熱恒溫水浴箱購于江蘇大唐醫療器械有限公司；LGJ-12真空冷凍干燥機購于北京松源華興生物技術有限公司；IKA RV10數顯型旋轉蒸發儀購于艾卡廣州儀器設備有限公司；Grimm 1109激光粒度分析儀購于德國Grimm公司；SP-300透射電子顯微鏡購于美國FEI公司；XH-D旋渦震蕩儀購于無錫久平儀器有限公司；H 1850臺式高速離心機購于湖南湘儀動力測試儀器有限公司；PHSJ-3F型/0.01級pH計購于上海儀電科學儀器股份有限公司；Heraguard ECO超凈工作臺購于美國Thermo Scientific；MJJ-160恒溫發酵培養箱購于常州市億能實驗儀器廠；GC-2010氣相色譜儀購于島津企業管理（中國）有限公司；Fox 4 000電子鼻購于法國Alpha M.O.S公司。

2 實 驗

2.1 魚油納米脂質體的構建及表征

精密稱取一定比例大豆磷脂和魚油溶解于乙醇中，然后在常溫的條件通過旋轉蒸發（轉速100 rpm）減壓干燥除去有機試劑，在磨口玻璃管底部及內壁形成一層均勻的脂質薄膜后，將其冷凍干燥6～8 h除去殘留有機試劑。加入適量超純水旋渦震蕩水化1 min左右，至形成乳白色均勻的多層脂質體囊泡后轉移至Avanti脂質體擠出儀配套的氣密注射器中，將其擠壓分別通過孔徑為100 nm、400 nm和1 000 nm的聚碳酸酯膜各20次來回[13]，制得3種尺寸的大豆磷脂-魚油納米脂質體，其總脂濃度均為5 mg/mL[14]。

對其外觀進行觀察，并使用數碼相機拍照；采用Grimm粒度儀測定其平均粒徑、粒徑分布指數(polymer dispersity index,PDI)和Zeta電位，設定波長為633 nm，折射率1.33，黏度值（0.8880 mPa·s），溫度為25°C[15-16]。

2.2 魚油納米脂質體酸奶的制備

首先將不銹鋼器皿用100℃沸水沖洗消毒，再按照脫脂乳粉：水的質量比為1∶5稱取脫脂乳粉和水于器皿中攪拌均勻，并使其在95℃水浴鍋中殺菌10 min，接著打開超凈工作臺，將樣品放入超凈工作臺內冷卻至45℃后，向其中接種質量分數為0.1%的乳酸菌，并輕微搖晃攪拌均勻。隨后按照脂質體：乳液體積比為1∶5分別量取通過孔徑為100 nm、400 nm和1 000 nm的聚碳酸酯膜制備出的魚油脂質體和乳液混合均勻并分裝在玻璃瓶中，蓋上蓋子并密封好放入42℃恒溫培養箱中發酵約10小時后乳液凝固[17]，即得到魚油納米脂質體酸奶，放入4℃冰箱進行后續分析測定。

2.3 pH、持水性和外觀氣味考察

2.3.1 酸奶p H值的測定

p H緩沖液的配制：將鄰苯二甲酸氫鉀放置于高溫烘箱中調至120℃干燥到恒重，并放入干燥器內冷卻至室溫，精密稱取鄰苯二甲酸氫鉀10.211 g并加入超純水溶解，轉入容量瓶中定容至1 L，即配得p H值為4.00的緩沖液1；將無水磷酸氫二鈉和無水磷酸二氫鉀放置于高溫烘箱中調至120℃干燥到恒重，并放入干燥器內冷卻至室溫，精密稱取無水磷酸氫二鈉3.549 g和無水磷酸二氫鉀3.402 g并加入超純水溶解，轉入容量瓶中定容至1 L，即配得p H值為6.88的緩沖液2。

pH計的標定[18]：打開pH計，點擊溫度，待其顯示出穩定的溫度值后點擊確認，調至測量頁面，用超純水沖洗電極3～4次后擦干，插入標準緩沖液1中，待數值穩定后點擊定位使p H值為4.00后點擊確認；同樣用超純水清洗電極擦干后插入標準緩沖液2中，標定其pH值為6.88后確認。

在標定完成后取一定量樣品讓其達到室溫，將p H計調至測量頁面，用超純水沖洗電極3～4次后擦干，插入樣品中，并輕輕攪拌，待p H計上的數值穩定后，讀出樣品的pH值并記錄。

2.3.2 酸奶持水性的測定

稱取酸奶樣品3 g左右于離心管中，并提前測量好空離心管的重量，記錄數值。將裝有酸奶樣品的離心管放入離心機中以500 rpm離心5 min后取出，倒去上清液，稱量離心后去除上清液的重量并記錄。

持水性（WHC）可由以下公式計算得出：

2.3.3 酸奶外觀和氣味的考察

將酸奶樣品等量分裝于小玻璃瓶中，分別將添加有超純水、通過100 nm、400 nm和1 000 nm濾膜的魚油脂質體酸奶做好標記，放于4℃冰箱中儲存，分別于1 d、7 d和14 d取出，對其外觀和氣味進行考察評價。

評價標準為：-：酸奶呈白色，無分層無異味；-+：酸奶呈白色，有少量乳清析出；+：酸奶呈白色有少量乳清和異味；++：酸奶呈微黃色、分層明顯，氣味腐臭。

2.4 DHA/EPA的定量GC分析

前處理：精密稱取1 g酸奶樣品于潔凈玻璃瓶中，加入3 mL正己烷、3 mL 0.8 mol/L KOH-甲醇和3 mL超純水，振蕩1 h后于37℃恒溫水浴中靜置30 min后，3 000 r/min離心10 min，取上清液進行下一步測試分析。

色譜條件：色譜柱：DB-5毛細管柱（30m×0.25mm×0.25um）；檢測器：FID；載氣：He；載氣流量：1.0 mL/min；進樣口溫度：270℃；柱溫：70℃保持5 min，以25℃/min升至200℃，以2℃/min升至240℃；檢測器溫度：320℃；進樣體積：1 uL；進樣方式：不分流[19]。

2.5 電子鼻氣味輪廓分析

精密稱取1 g分別添加有通過100 nm、400 nm和1 000 nm濾膜的魚油脂質體和等體積超純水的酸奶樣品于洗凈并烘干冷卻后的10 mL自動進樣瓶中，蓋好蓋子裝進機器等待測量，每組樣品包含四個平行，選取最優三個平行進行分析。

電子鼻分析條件：載氣為潔凈空氣，流速為150 mL/min，頂空產生溫度為50℃，產生時間為600 s，進樣器溫度為60℃，進樣體積為2 500μL，進樣時間為1 s，數據采集時間120 s[20-21]。利用儀器中自帶的Alphasoft V11統計分析軟件對不同酸奶樣品數據進行采集和處理。

2.6 數據處理

酸奶p H和持水性的數據采用使用Excel2010軟件對其進行均值/標準差的計算和顯著性分析。

3 結果與討論

3.1 魚油納米脂質體的表征

3.1.1 魚油納米脂質體外觀

圖1 通過3種不同濾膜孔徑所制備出的大豆磷脂-魚油脂質體及超純水外觀對比圖

此圖中標記有1、2、3的玻璃瓶中的樣品分別為通過孔徑為100 nm、400 nm和1 000 nm濾膜的大豆磷脂-魚油脂質體，其總脂肪濃度均為5 mg/mL，標記有4的玻璃瓶中為等體積的超純水。由圖1可見，通過孔徑為100 nm、400 nm和1 000 nm濾膜的大豆磷脂-魚油脂質體在5 mg/mL濃度下為均勻乳白色液體狀，顏色深淺無明顯差異，超純水對照呈透明狀；4℃冰箱放置一天后次濃度脂質體樣品均無沉淀，說明其品質較好，可作為營養強化劑應用于酸奶中。

3.1.2 魚油納米脂質體粒徑分布與Zeta電位

由表1可見，魚油脂質體的平均粒徑經Grimm 1109粒度儀測定在123～173 nm之間不等，通過使用不同孔徑的聚碳酸酯膜可對魚油脂質體的尺度進行調控，總體Zeta電位的絕對值在21～39 mv，且尺度的增大會使魚油脂質體中DHA/EPA的電荷增多，均一度有所減小，說明此魚油脂質體體系較穩定。

表1 不同尺度魚油脂質體的平均粒徑、PDI、Zeta電位

3.2 魚油納米脂質體酸奶的p H、持水性和外觀

表2 不同酸奶樣品在不同儲藏時間的pH和持水性

由表2可以看出，4種酸奶樣品的p H和持水性隨貯藏時間的推移均呈逐漸下降趨勢。pH在1～7 d的減少量明顯大于7～14 d的減少量，添加有通過1 000 nm濾膜魚油脂質體的酸奶其在7～14天pH的減少量相比較于其他樣品明顯較多，故通過100 nm和400 nm濾膜的魚油脂質體對酸奶p H的影響較小。

在第一天，添加有通過1 000 nm濾膜魚油脂質體的酸奶持水性明顯低于其他3組酸奶樣品，而添加有通過100 nm濾膜魚油脂質體的酸奶持水性在1～7 d內無明顯下降，而在14天4種酸奶的持水性無明顯差異，故通過100 nm濾膜的魚油脂質體使酸奶持水性在1～7天的變化較少。

圖2 添加有不同魚油脂質體和等量超純水酸奶的外觀圖

圖2左側中從左到右前4個樣品瓶分別呈裝了添加有通過孔徑為100 nm、400 nm和1 000 nm濾膜的大豆磷脂-魚油脂質體和等量超純水的酸奶，展示了其倒放后的外觀狀態，右圖為其正放置的狀態，可看出其均呈乳白色，樣品倒立不會流出，呈凝固狀，4種酸奶外觀無明顯差異。

評價標準：-：酸奶呈白色，無分層無異味；-+：酸奶呈白色，有少量乳清析出；+：酸奶呈白色有少量乳清和異味；++：酸奶呈微黃色、分層明顯，氣味腐臭。

由表3可以看出，4種酸奶在制備出后儲藏1 d后外觀正常，均無分層和異味，都呈乳白色，在儲藏7 d后，添加有魚油脂質體的酸奶均產生一定的異味，有少量分層出現，而超純水對照組未產生異味；在儲藏14 d后，添加有魚油脂質體的酸奶均產生腐臭的氣味，且酸奶呈微黃色，有明顯的分層，而添加有超純水的酸奶與其相比氣味較輕，顏色仍為白色。總體來說，添加有三種不同魚油脂質體的酸奶的外觀和氣味人工感官在14 d內的變化趨勢無明顯差異，而添加有超純水的酸奶外觀和氣味品質較穩定。

表3 添加有不同魚油脂質體和超純水酸奶在不同儲藏時間的外觀氣味特性

3.3 DHA/EPA的定量GC分析

圖3 添加有不同魚油脂質體酸奶儲藏一個月后的GC色譜圖

圖中(a)、(b)、(c)分別代表添加有通過孔徑為100 nm、400 nm和1 000 nm濾膜的大豆磷脂-魚油脂質體酸奶儲藏一個月后的GC色譜圖。圖中EPA和DHA出峰的時間分別約為24.5 min和30.1 min，可看出圖（a）的峰形較高，峰面積較大，說明通過孔徑為100 nm濾膜的大豆磷脂-魚油脂質體酸奶在儲藏一個月之后的DHA和EPA含量較高，峰面積隨濾膜孔徑的增大略有減小。

圖4 添加有不同魚油脂質體的酸奶儲藏一個月后DHA/EPA的含量

圖中樣品1、2、3分別代表添加有通過孔徑為100 nm、400 nm和1000 nm濾膜的大豆磷脂-魚油脂質體酸奶樣品。由圖可見，隨脂質體制備過程中濾膜孔徑的增加，酸奶儲藏一個月后其中的DHA和EPA的含量略微下降，樣品2和樣品3的EPA含量略高于DHA含量，而樣品1的DHA和EPA含量無明顯差異。可得出，在酸奶體系中，通過孔徑為0.1μm濾膜脂質體可以對魚油中活性成分DHA/EPA有較好的保護效果。

3.4 電子鼻氣味輪廓分析

PC1和PC2分別是PCA轉換中得到的第1主成分和第2主成分的方差貢獻率，可有效反應原始各氣味指標的信息，總貢獻率在大多情況下高于85%為宜。由圖中可以看出，PC1和PC2已經包含了原始數據的大量信息，PCA圖可較好反映添加有不同魚油納米脂質體在的酸奶不同時間的氣味輪廓差異[22]。

從圖5可看出，在酸奶剛制備出的第一天，4種樣品氣味傳感器數據點均有重疊，表明添加有通過不同濾膜孔徑的魚油脂質體酸奶的氣味無明顯差異，說明脂質體能對魚油的氣味得到較好的包埋效果。

在酸奶放置于冰箱4℃冷藏7 d后，4種樣品氣味數據點漸漸分散幾乎無重疊，其中添加有通過1 000 nm濾膜的魚油脂質體酸奶與添加有等量超純水酸奶的數據點較遠，氣味輪廓差異較明顯，而添加有通過100 nm濾膜的魚油脂質體酸奶與添加有通過400 nm濾膜的魚油脂質體酸奶的數據點有重疊，氣味較接近，表明在經過7天的冷藏后，添加有通過不同濾膜孔徑的魚油脂質體和等量超純水的酸奶的氣味發生了改變，且此部分酸奶樣品的氣味可得到區分，說明脂質體在酸奶體系中能對魚油的氣味包埋的穩定性在七天有所下降。

在酸奶經過4℃冷藏14 d后，添加有超純水的酸奶和添加有脂質體的酸奶的氣味傳感器數據點距離較遠，氣味輪廓有了明顯的差異，而添加有通過3種不同濾膜孔徑的魚油脂質體的酸奶數據點有部分重疊，距離較近，氣味輪廓無明顯差異，可見魚油脂質體在酸奶的體系中經過14 d冷藏受到一定的破壞，魚油均發生酸敗氧化，產生揮發性物質，氣味品質明顯下降，與對照組差異明顯。

4 結論與展望

圖5 不同酸奶樣品在1d、7d和14d的揮發性氣味PCA圖

本文采用擠出法以大豆磷脂作為壁材制備出不同尺度5 mg/mL的高濃度魚油脂質體，其外觀都呈均勻乳白色，粒徑分布整體較集中，均一性隨尺度的增加有所下降，其Zeta電位隨尺度的增加有所增加；不同尺度魚油脂質體對酸奶外觀的影響無明顯差異，而較小尺度魚油脂質體的添加使酸奶的pH和持水性變化較慢，酸奶經儲藏30 d后的DHA和EPA的含量隨尺度的增加有所減少；添加有三種不同尺度魚油脂質體的酸奶與超純水對照組酸奶在冷藏7天后的氣味輪廓出現了一定差異，14天后添加有魚油脂質體的酸奶與添加有等量超純水的酸奶的氣味出現了明顯的差異。使用孔徑為100 nm的聚碳酸酯膜擠壓法制備的脂質體對魚油在酸奶中的DHA和EPA具有較好的保護效果，其應用于酸奶加工中具有較大潛力。今后，可進一步對魚油脂質體應用于酸奶中的氣味控制及保藏方法進行研究，實現富含DHA和EPA等營養素酸奶的工業化生產，推動中國乳品工業的發展。