乳清液制備細菌纖維素條件的優化

王英男,黃艷玲 ,劉琳 ,楊文敏，吳磊，李佳棟

(1.黑龍江省綠色食品科學研究院，哈爾濱 150028；2.黑龍江省科學技術情報研究院，哈爾濱 150028)

0 引 言

乳清是生產干酪、干酪素的副產品，是從牛乳中分離出來的總固形物含量為6.0%～6.5%的不透明的淺黃色液體[1]。一般每生產1 kg干酪可得到8～9 kg乳清。目前，全球乳制品加工排放的乳清液總產量約為（1.8～1.9）×108t/年，僅有約50%的乳清液被處理和使用，其中，被處理的乳清液中僅有30%用于生產乳清粉[2]。作為副產品的乳清產量，分別是主要產品干酪、干酪素產量的9倍和27倍。近年來，干酪成為全世界消費量唯一保持連續上升的乳制品。而我國對乳清的開發與綜合利用則剛剛處于起步階段，回收的乳清加工生產的產品較少，且未形成規模化生產，尚待進一步的加強。乳清的回收與利用對于提高產品質量、降低成本、增加企業經濟效益，以及防止環境污染具有重要意義。從利用的量上講，目前只利用了其中一小部分，而大部分乳清返回牧場作飼料或被排放掉，這不僅浪費了營養資源，降低了企業效益，而且也造成了嚴重的環境污染。因此，合理開發大量乳清資源已成為亟待解決的問題。

1886年Brow首次報道了細菌纖維素，其后，很多學者進行了大量的研究，尤其最近幾年，國內外對于細菌纖維素制備與應用領域的研究更是層出不窮。2019年Khamkeaw[3]等人研究細菌纖維素活性炭作為去除水溶液染料的有效吸附劑，給水處理凈化開辟了新的途徑；Gayathri,G[4]等人以粗酒廠廢水為廉價、經濟有效的原料發酵生產細菌纖維素；張沙沙[5]等人利用木薯水解液為發酵培養基，有效提高了纖維素的產量；劉暢[6]等人研究各類條件生產細菌纖維素，闡述的比較詳盡全面。細菌纖維素與植物纖維素相比具有很多優異的性質，主要表現為較高的純度、不含半纖維和木質素等雜質；良好的生物相容性和生物可降解性；較好的持水性和復水率；較高的彈性模量等性質。因此，細菌纖維素被廣泛的應用在食品、造紙、紡織和醫學等領域[7]。本實驗以乳品廠排放的乳清液為培養基的主要原料，探索生產細菌纖維素的新方法。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種

木醋桿菌（Acetobacter Xylinum），由實驗室分離純化篩選而得。

1.1.2 原料與試劑

乳清液，由黑龍江鞍達實業集團股份有限公司提供；葡萄糖購于天津市天力試劑有限公司；酵母浸粉購于北京奧博星生物技術有限責任公司；其他試劑均為國產分析純。

1.1.3 培養基

斜面固體培養基：葡萄糖40 g，酵母浸粉10 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 L。pH4.5，121℃滅菌15 min。

液體種子培養基：葡萄糖40 g，酵母浸粉10 g，蒸餾水1 L。p H 4.5，121℃滅菌15 min。

發酵培養基：乳清液培養基。121℃滅菌15 min。

1.2 實驗儀器

主要儀器與設備(見表1)

表1 實驗儀器

1.3 實驗方法

1.3.1 乳清液的預處理

參照朱珠[8]的方法，并作適當的修改，具體處理方法：乳清液5 000 r/min離心10 min。

1.3.2 乳清液成分的測定

參照孟宏昌[9]的方法，并做適當的修改，具體方法如下：

總糖的測定：苯酚硫酸法；

蛋白質的測定：利用雙縮脲法測定。

1.3.3 種子液的制備

挑取一環活化好的斜面菌苔接種于含100 mL種子培養基的250 mL三角瓶中，30℃靜止培養16 h。

1.3.4 細菌纖維素合成量的測定

參照崔思穎[10]的方法，并作適當的修改，具體方法如下：用蒸餾水沖洗細菌纖維素以除去膜表面培養基及雜質。用1%的NaOH溶液80℃水浴30 min，并持續用NaOH溶液浸泡至纖維素膜呈透明白色。再用蒸餾水沖洗，至纖維素膜為中性，60℃烘干至恒重并進行稱量，干重為每100 mL培養液含有的干纖維素的質量，單位為g/100 mL。

1.3.5 發酵后培養液的處理及殘糖的測定

參照張雯[11]的方法：細胞懸液10 000 r/min離心10 min；殘糖的測定：苯酚硫酸法測定。

2 結果與討論

2.1 乳清液成分測定結果（見表2）

表2 乳清液主要成分組成 （mg.mL-1）

2.2 葡萄糖添加量對細菌纖維素合成量及葡萄糖利用率的影響

添加葡萄糖補充木醋桿菌生長所需的碳源，使木醋桿菌更好的生長。經試驗摸索及查閱相關文獻，將葡萄糖添加量定為2%、4%、6%、8%、10%、12%，其他影響因素不變，結果如圖1所示。

圖1 葡萄糖添加量對細菌纖維素合成量及葡萄糖利用率的影響

由圖1可知，在發酵溫度30℃，發酵時間6 d，接種量6%，p H 4.5的條件下，隨著葡萄糖添加量的增加，細菌纖維素的合成量以及葡萄糖的利用率先增加后減少，在葡萄糖添加量為8%時，細菌纖維素的合成量達到最大值0.81 g/100 mL，葡萄糖的利用率最大為96.89%。在葡萄糖添加量為10%和12%時，培養基溶液濃度過高，不適宜菌體的生長，所以纖維素的合成量及葡萄糖利用率較低。關曉輝[12]等人研究利用玉米漿干粉為發酵基質，確定葡萄糖最佳添加量為5%～6%，與其結果不一致的原因可能是玉米漿干粉中含有一定量的糖，而乳清液中含糖量較低需要補充較多糖作為微生物生長所需的碳源。

2.3 發酵時間對細菌纖維素合成量及葡萄糖利用率的影響

在發酵溫度30℃，葡萄糖添加量8%，p H 4.5，接種量為6%的條件下，考察5、6、7、8、9、10 d對細菌纖維素合成量及葡萄糖利用率的影響。

由圖2可知，隨著發酵時間的增加，細菌纖維素的合成量及葡萄糖的利用率呈現增加的趨勢，從經濟使用方面考慮，發酵的最佳時間定為7 d。與黃丹[13]等人的研究結果一致，其研究木醋桿菌生產細菌纖維素的最佳發酵時間為6～8 d。

圖2 發酵時間對細菌纖維素合成量及葡萄糖利用率的影響

2.4 發酵溫度對細菌纖維素合成量及葡萄糖利用率的影響

在葡萄糖添加量8%，p H 4.5，以6%的接種量接入液體發酵培養基中，分別在15、20、25、30、35℃條件下恒溫靜止培養7 d，結果如圖3所示。

圖3 發酵溫度對細菌纖維素合成量及葡萄糖利用率的影響

由圖3可知，隨著發酵溫度的升高，細菌纖維素的合成量及葡萄糖的利用率先增加后減少，在30℃時，細菌纖維素的合成量達到最大0.20 g/100 mL，葡萄糖利用率為98.50%。與錢子俊[14]的研究結果一致，其研究為利用大豆酶解液生產細菌纖維素，在發酵溫度為28～32℃時，細菌纖維素的產量最大。

2.5 接種量對細菌纖維素合成量及葡萄糖利用率的影響

接種量的大小決定發酵周期的長短，采用適宜的接種量，可以縮短發酵周期，積累大量的產物。如果接種量過多或過少，都不利于菌體的生長和產物的積累，使得發酵周期較長[15]。

根據宗丹[16]等人的實驗經驗描述，選擇考察接種量為2%、4%、6%、8%、10%、12%對細菌纖維素合成量及葡萄糖利用率的影響，結果如圖4所示。

由圖4可知，在發酵溫度30℃，葡萄糖添加量8%，pH 4.5，發酵時間為6 d的條件下，隨著接種量的增加，細菌纖維素的合成量及葡萄糖利用率先增加后減少，在接種量為6%時，細菌纖維素的合成量最大為0.14 g/100 mL，葡萄糖的最大利用率為88.50%。與湯衛華[17]等人的研究不一致，其研究誘變的木葡糖酸醋桿菌生產細菌纖維素，當接種量為8%時，細菌纖維素的產量最高，原因可能是誘變的木葡糖酸醋桿菌采用較大的接種量時，才有利于產物的積累。

圖4 接種量對細菌纖維素合成量及葡萄糖利用率的影響

2.6 初始pH對細菌纖維素合成量及葡萄糖利用率的影響

pH值對微生物的生產及產物的合成具有很大的影響，通常會改變菌體對底物的利用速度，從而影響產物的合成和積累[18]。p H值為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5對細菌纖維素合成量及葡萄糖利用率的影響，結果如圖5所示。

圖5 初始pH對細菌纖維素合成量及葡萄糖利用率的影響

由圖5可知，隨著p H的增加，細菌纖維素的合成量及葡萄糖利用率呈現先增加后減少的趨勢，在p H為5.0時，細菌纖維素的合成量最大為1.34 g/100 mL，葡萄糖的最大利用率為98.70%。與張沙沙[19]等人的研究結果一致。

3 結 論

通過實驗確定了木醋桿菌生產細菌纖維素的最佳條件：8%葡萄糖添加量、發酵時間7 d、發酵溫度為30℃、接種量6%、初始p H 5.0。在此條件下，細菌纖維素的產量為1.40 g/100 mL，葡萄糖利用率為97.5%。這與程建軍[20]等人的研究結果是一致的。以乳清液為發酵基質生產細菌纖維素，不僅解決了乳清液對環境的污染，而且充分利用了資源，同時創造了一定的社會效益和經濟效益。