牛乳中β-酪蛋白基因分型及β-酪啡肽-7的研究進展

陳龍，付王艷，方瓊燕，唐果，劉論，向松濤

(1.新希望乳業股份有限公司，成都 610023；2.四川新希望畜牧科技有限公司，成都 610042；3.乳品營養與功能四川省重點實驗室，成都 610023)

0 引 言

牛乳營養豐富，食用便利，富含優質的蛋白質、碳水化合物、脂肪、維生素和微量元素，牛乳中的蛋白質含有人體所需的全部必需氨基酸，消化率可達98%～100%，因此被認為是自然界最接近完美的食品。乳蛋白是牛乳中最主要和最有營養價值的成分，其含量約占牛乳的3.0%～3.6%，主要以酪蛋白和乳清蛋白為主，還有少量的酶類。酪蛋白是由αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、γ-酪蛋白等多種蛋白質組成的混合物，總含量約占乳蛋白的80%。β-酪蛋白目前已鑒定出至少有13種變體，其中A1和A2型是最常見的兩種類型。A1型β-酪蛋白在人體消化道中經過酶解可產生β-酪啡肽-7(Beta-casomorphin-7，BCM-7)，可以被直接吸收，與人體多個生理系統相互作用，推測其可能與1型糖尿病、心血管疾病、自閉癥、精神分裂癥、消化功能紊亂等慢性非傳染性疾病的發生有密切關系，但目前動物及人體相關試驗在這方面仍然還沒有定論。本文闡述了β-酪蛋白的基因多態性及分型方法、BCM-7的生成機制及其對人體健康的潛在影響，為β-酪蛋白及A2型牛乳在乳制品行業的研究與開發提供一定的理論參考。

1 β-酪蛋白基因和分型

1.1 β-酪蛋白基因變異類型

β-酪蛋白由牛基因組的第6號染色體編碼209個氨基酸組成，分子量為23983[1]。迄今為止已發現了13種遺傳變體，分別為A1、A2、A3、A4、B、C、D、E、F、G、H 1、H 2和I，其中A4變體在韓國本地牛中發現，但未經確認，每個變體根據肽鏈特定點位氨基酸的不同相區分[2]。在牛乳中，β-酪蛋白最常見的類型是A1型和A2型，其他類型很少見，A2型β-酪蛋白是最原始的類型，是定義其他類型的參考蛋白[3]。例如，組氨酸由CAT堿基編碼，而脯氨酸由CCT堿基編碼，由于自然遺傳突變，胞嘧啶被腺嘌呤（C→A）所取代，因此A1型β-酪蛋白是由A2型β-酪蛋白肽鏈的第67位脯氨酸突變為組氨酸導致的變體。據研究考證，這次遺傳突變發生在大約五千至一萬年前的土耳其安納托利亞[4]，后來A2型和A1型又分別發生了一系列微小的變異形成了其他變體。β-酪蛋白八種主要變體的氨基酸序列變化情況如表1所示。

表1 β-酪蛋白8種主要變體的氨基酸序列變化情況

1.2 β-酪蛋白基因分型方法

基因多態性是指在基因組水平上，由于堿基的缺失、插入、重復或置換等引起的核酸序列的變異，導致同一基因位點可存在兩種或多種基因型。Martin等[5]的研究表明，乳蛋白多態性是受常染色體上共顯性基因所控制的，因此β-酪蛋白的A1和A2等位基因具有相同機率表達A1型或A2型β-酪蛋白。β-酪蛋白基因多態性可通過蛋白水平或分子水平進行檢測。蛋白水平的檢測方法主要包含反相高效液相色譜(Reversed-phase high-performance liquid chromatography,RP-HPLC)、毛細管區帶電泳[6-7]、等電點聚焦[8]、雙向凝膠電泳[9]等方法。分子水平的檢測方法主要包含等位基因特異性PCR(Allele specific PCR,AS-PCR)、限制性片段長度多態性PCR(PCR restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)、單鏈構象多態性PCR(Single strand conformation polymorphism PCR,SSCP-PCR)、創造酶切位點PCR(Amplification created restriction site PCR,ACRS-PCR)等方法，近年來還出現了TaqMan法、焦磷酸測序法等新興的β-酪蛋白基因檢測技術。

1.2.1 RP-HPLC方法

RP-HPLC方法操作簡便，靈敏度高，是最常見的用于分離和定量牛乳中蛋白質變異體的方法，具有很大的應用潛力。繆淑穎等[10]采用RP-HPLC方法檢測了102頭中國荷斯坦奶牛牛乳中6種主要乳蛋白的多態性，結果表明β-酪蛋白的類型最多，并成功測定了A1和A2的基因型頻率。Bonfatti等[11]也成功應用RP-HPLC方法在40 min內分離鑒定了地中海水牛乳中不同基因類型的酪蛋白和乳清蛋白。

1.2.2 AS-PCR方法

AS-PCR方法是指在引物3'端設計與模板(等位基因)匹配或錯配的堿基，通過擴增出相應的基因片段達到區分模板(等位基因)的目的。Keating等[12]和Rahimi等[13]在研究牛群β-酪蛋白基因分型時都基于該方法，設計正向引物為5'-GCC CAG ATG AGA GAA GTG AGG-3'，反向引物1(A1等位基因)為5'-GAT GTT TTG TGG GAG GCT GTT AT-3'，反向引物2(A2等位基因)為5'-GAT GTT TTG TGG GAG GCT GTT AG-3'，當加入不同特異反向引物1或2進行PCR擴增后，可根據DNA片段條帶的不同來區分和鑒定A1或A2等位基因。

1.2.3 PCR-RFLP方法

PCR-RFLP方法是指用特異設計的PCR引物擴增靶DNA，再用特異性內切酶將擴增產物切割成不同長度的DNA片段，最后通過凝膠電泳分析。不同等位基因的限制性酶切位點分布不同，因此可以產生不同長度的條帶，從而區分出不同的等位基因，該方法操作簡便，耗時較短，是利用分子手段檢測基因分型的常用方法。Miluchová等[14]和Shende等[15]都根據McLachlan[16]的專利內容，設計了一對引物5'-CCT TCT TTC CAG GAT GAA CTC CAG G-3'和5'-GAG TAA GAG GAG GGA TGT TTT GTG GGA GGC TCT-3'，分別對斯洛伐克平茨古牛和荷斯坦牛的DNA樣本進行PCR擴增，均可獲得長度為121 bp的DNA片段，利用Dde I限制性內切酶切割后進行電泳分辨，成功測定了A1和A2的等位基因頻率和基因型頻率。

1.2.4 SSCP-PCR方法

SSCP-PCR方法是一種基于單鏈DNA空間折疊構象差異點狀突變的檢測方法。相同長度的單鏈DNA如果堿基排列順序不同就會導致不同的空間折疊構象，在經過PCR擴增和產物復性后，進行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳時，不同構象DNA的泳動速度就會不同，據此可判斷DNA片段中發生了堿基突變。Barroso等[17]運用此方法成功鑒定了65只不同牛種的β-酪蛋白A1、A2、A3和B等位基因，并認為此方法經濟、高效、靈敏。Cui等[18]也采用該方法鑒定了中國麥洼牦牛β-酪蛋白的基因類型，新發現了兩種麥洼牦牛β-酪蛋白遺傳變體(JN 655524和JN 655525)，它們顯示出明顯不同的電泳遷移模式。

1.2.5 ACRS-PCR方法

ACRS-PCR方法是指應用引物錯配技術結合單堿基突變位點而形成一個酶切位點，其PCR擴增產物可以用PCR-RFLP方法分析，從而對單堿基突變位點進行基因型鑒定。Hanusová等[19]使用該方法鑒定了斯洛伐克97頭荷斯坦奶牛β-酪蛋白的A1和A2基因型。Ramesha等[20]利用此法結合TaqI限制性內切酶對印度391頭水牛進行了β-酪蛋白A1和A2基因型的鑒定，發現A2純合型PCR擴增片段長度為251 bp，A2基因型頻率為100%。

1.2.6 TaqMan方法

TaqMan方法是近年來發展起來的綜合PCR與熒光標記技術用來準確定量PCR的代表性方法，由引物和探針雙重控制目標序列的選擇，克服了傳統PCR方法費時、易污染等缺點，具有簡單易操作、特異性強、靈敏度高等優點。Manga等[21]采用TaqMan熒光探針建立了一種新的等位基因鑒定方法，用于檢測120頭荷斯坦奶牛β-酪蛋白的A1和A2基因型，結果發現與ACRS-PCR法相比，TaqMan法檢測β-酪蛋白基因標記物更有效，具有100%的可靠性，且靈敏度高出100倍。Poulsen等[22]通過該方法分析丹麥荷斯坦奶牛、丹麥澤西牛、瑞典紅牛等3個奶牛品種的牛乳凝固特性與酪蛋白遺傳變異的關系，研究表明TaqMan法成功地對所有常見的αs1-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白變體進行基因分型。

1.2.7 焦磷酸測序方法

焦磷酸測序法是近年來興起的一項DNA快速測序技術，適于對短到中等長度的DNA序列樣品進行測序分析，具有高通量、低成本、精確性和重復性好等特點，因而廣泛應用于單核苷酸多態性、毒理學及病原微生物鑒定等多個領域。任大喜等[23]使用該方法分析了中國荷斯坦牛、娟姍牛及水牛的乳蛋白基因多態性，并采用高效液相色譜法進行驗證，結果表明焦磷酸測序法能高通量、快速且準確地測定乳蛋白基因多態性。Zhong等[24]使用該方法分析了85種來自不同乳源和地理位置的天然發酵乳品中微生物的多樣性，發現該方法可以大量快速地測定不同樣品微生物的16SrRNA基因。

1.3 β-酪蛋白基因頻率

目前國際上主要的奶牛品種包括荷斯坦牛、娟姍牛及西門塔爾牛，其他品種還有亞洲地區的水牛和牦牛，歐美地區的更賽牛、愛爾夏牛、褐牛和紅牛等。研究表明，β-酪蛋白的基因頻率及基因型頻率因奶牛的品種、國家或地理分布等因素影響而呈現顯著差異[25]。Misra等[26]研究了印度不同地區產奶動物的β-酪蛋白基因分型情況，發現8個品種231頭水牛樣本的A2等位基因頻率為100%。任大喜等[23]分析中國荷斯坦牛和娟姍牛的乳蛋白基因多態性，發現荷斯坦牛β-酪蛋白的基因型以A1純合型為主(67.78%)，A1等位基因頻率為69.44%，A2等位基因頻率為28.89%；娟姍牛β-酪蛋白的A1等位基因頻率為32.46%，A2等位基因頻率為42.11%。Winkelman等[27]研究了新西蘭本地1328頭娟姍牛酪蛋白的基因差異，發現A2等位基因頻率為59.1%。Eenennaam等[28]研究了美國加利福尼亞州21個農場5種奶牛所產牛奶的蛋白質多態性，發現瑞士褐牛的A2等位基因頻率為54%左右。Bech等[29]研究了丹麥3種奶牛酪蛋白的基因多態性，發現丹麥紅牛的A2等位基因頻率僅為23%。總的來說，亞洲地區本土的水牛等奶牛品種生產的牛乳大部分是A2型，而歐美及澳新地區的雜交奶牛如荷斯坦牛、娟姍牛、丹麥紅牛、愛爾夏牛等品種普遍生產A1型牛乳[30]。

2 BCM-7及其生成機制

2.1 BCM-7

β-酪蛋白富含生物活性肽，對鐵、鈣、鋅、鎂等微量金屬元素離子的運輸發揮著至關重要的作用。Brantl等在1979年首先發現了豚鼠在飼喂一種酪蛋白酶解制劑時其回腸縱行肌毛細血管中存在一種呈阿片活性的物質，為β-酪蛋白第60-66點位上的氨基酸殘基片段(Tyr60-Pro61-Phe62-Pro63-Gly64-Pro65-Ile66)，命名為β-酪啡肽-7(BCM-7)。它具有很高的阿片活性，能與μ型阿片受體表現出良好的親和力[31]。

2.2 BCM-7的生成機制

A1型β-酪蛋白在肽鏈第67號點位上是組氨酸，而A2型β-酪蛋白是脯氨酸，這種差異造成A1和A2型β-酪蛋白第66與第67氨基酸之間肽鍵的敏感性不同，導致對人體消化道的酶解反應也不同。異亮氨酸和組氨酸之間(A1型)的肽鍵在消化道內可被彈性蛋白酶裂解，而異亮氨酸和脯氨酸之間(A2型)的肽鍵不會被裂解，因此，只有A1型β-酪蛋白在正常酶解后會產生BCM-7，A2型則不會產生[32]。其生成機制如圖1所示。

圖1 A1和A2型β-酪蛋白肽鏈結構及BCM-7的生成

3 BCM-7對人體健康的潛在影響

牛乳具有豐富的營養，能為人體提供大量優質的蛋白質及微量元素，早已成為西方發達國家人們的必備食物之一。隨著BCM-7的發現以及對乳源生物活性肽的深入研究，國外越來越多的研究表明BCM-7可能與1型糖尿病、心血管疾病、精神障礙、胃腸道不適等疾病的發生有著顯著的聯系，引起了西方各國學者的普遍重視，但我國在這方面的研究還比較欠缺。由于BCM-7只產生于含有A1型β-酪蛋白的牛乳，這將引發人們對飲用A1型牛乳對健康影響的擔憂。

3.1 1型糖尿病

1型糖尿病是一種自身免疫系統缺陷疾病，多發生在兒童和青少年，患者體內的多種異常自身免疫抗體損傷了胰腺B細胞，導致其不能正常分泌胰島素，患者需要每天注射胰島素來控制血糖水平[33]。Laugesen等[34]對英國、芬蘭、瑞典等19個國家12913名0-14歲的兒童進行了牛乳蛋白每日攝入量與1型糖尿病發病率的關系數據研究，結果顯示A1型牛乳、總乳蛋白和A2型牛乳與1型糖尿病發病率的相關系數(r)分別為0.92、0.68和0.47，說明A1型β-酪蛋白的攝入及其代謝產物BCM-7與1型糖尿病的發生有密切關系。對于飲用牛乳引發1型糖尿病的潛在作用機制目前仍然存在爭議，一方面有研究[35-37]認為，BCM-7可以抑制機體的免疫系統，增強病原體如腸道病毒或細菌的存活率，這些病原體最終參與引發1型糖尿病。另一方面的研究[38-39]認為，BCM-7的氨基酸序列結構與葡萄糖轉運蛋白-2(Glucose transporter-2，GLUT-2)類似，BCM-7會模擬GLUT-2參與細胞內的葡萄糖轉運并激活免疫應答機制，T細胞將它們識別為抗原并刺激B細胞產生抗體，抗體不僅靶向BCM-7，而且還會靶向產生胰島素的B細胞，從而引起1型糖尿病。

3.2 心血管疾病

缺血性心臟病或冠心病是心血管疾病的主要類型。Laugesen等[34]研究了1975年至1995年間18個國家的人群膳食結構與缺血性心臟病的聯系，發現35-64歲患缺血性心臟病的死亡率與A1牛乳攝入量之間的相關系數(r)為0.76-0.82，與其他攝入膳食指標相比，A1牛乳的攝入量與缺血性心臟病之間的相關性最為密切。McLachlan[40]也研究了16個國家30-69歲年齡段的男性攝入A1型牛乳與缺血性心臟病發病率之間的關系，發現因該疾病導致的死亡率和牛乳中的蛋白質有很強的相關性(r=0.86)，并推測BCM-7是導致心血管疾病的重要病因。研究表明[35,41-42]，BCM-7可能參與低密度脂蛋白（Low-density lipoprotein,LDL）的氧化過程或者LDL脂質組分的過氧化過程，氧化后的LDL可與巨噬細胞表面的特定受體結合并被巨噬細胞吞噬，這些巨噬細胞最終會轉化為泡沫細胞，從而導致心臟動脈粥樣硬化。Heinecke[43]的研究也證實了這種可能性，他分析了從人體動脈粥樣硬化病變組織分離出的蛋白質氧化產物，發現酪氨酸自由基在LDL的氧化反應中扮演重要角色，這也間接表明BCM-7與心血管疾病的發生關系密切。

3.3 精神障礙疾病

自閉癥和精神分裂癥都是精神障礙疾病，最典型的特征是社交障礙，主要表現為社交隔離、言語困難、智力發育障礙、活躍過度、自戕自殘、恐慌發作以及無目光接觸等，這些障礙癥狀可以通過改變飲食習慣來改善[44]。Cade等[45]對70名1-8歲的兒童自閉癥和精神分裂癥（漏腸綜合征）患者的跟蹤研究顯示，這些患者的尿液中可以檢測出大量的BCM-7，通過無麩質和無酪蛋白的飲食后，尿液中的BCM-7含量明顯降低，81%的患者的精神障礙癥狀得到顯著改善。另有研究證實[46,47]，麥醇溶蛋白和酪蛋白可釋放胃腸內的炎癥細胞因子，而炎癥性腸病患者同時患自閉癥、抑郁癥在內的精神障礙疾病的幾率會增加。

3.4 消化功能紊亂

部分人群飲用牛乳后會出現腹脹、腹瀉、腸絞痛等不適癥狀，通常認為是這部分人群患有乳糖不耐受。乳糖不耐受是由于人體腸道乳糖酶含量少，不能完全消化分解牛乳中的乳糖所引起的，不同國家或地區乳糖不耐受發生率不同，在遠東地區發生率較高。但Sun等[48]對我國45名漢族人群分別飲用A1型和A2型牛乳的研究顯示，有些乳糖不耐受病例或許與乳糖無關，可能與飲用含有A1型β-酪蛋白的牛乳有關，潛在的機制是A1型β-酪蛋白經消化酶解后可產生BCM-7，其發揮一系列促炎癥作用破壞了正常的消化過程從而表現出乳糖不耐受的癥狀，而飲用A2型牛乳則可緩解或預防乳糖不耐受癥狀。Ho等[49]對41名志愿者進行了為期8周的隨機雙盲交叉試驗，結果表明與A2型牛乳相比，攝入A1型牛乳會導致更高的大便稠度值（布里斯托大便分類法），大便稠度值與腹痛之間也有顯著關系(r=0.52,p=0.001)，這與A1型牛乳含有BCM-7密切相關。

4 展 望

過去二三十年間，世界各國對牛乳中β-酪蛋白的基因分型及BCM-7的生理特性進行了廣泛研究，統計數據顯示，長期飲用A1型牛乳與1型糖尿病、心血管疾病、自閉癥等人體非傳染性疾病的發生有顯著的相關性，但同時動物及人體試驗結果仍舊沒有給出實質性的證據，因此A1型牛乳是否致病仍存在爭議。

隨著我國人民生活水平的提高和對美好生活的追求，人們對優質、安全、營養、易消化吸收的牛乳及其制品的需求不斷提升，對牛乳的消費認識已經從“喝上奶”向“喝好奶”轉變。雖然亞洲地區本土奶牛品種生產的牛乳大部分屬于A2型，但隨著本地區牛乳消費量的激增，亞洲各國引進了許多歐美及澳新地區的高產奶牛或者進行雜交改良，這個過程可能會引入A1等位基因。鑒于A1型牛乳對人體健康影響的不確定性，未來普通型牛乳和A2型牛乳的消費人群會得到細分，A2型牛乳或將成為一種高端產品面向市場，相關科研機構及乳制品企業也將加大A2型牛乳及其對人體健康影響方面的深入研究。