PTSD樣大鼠記憶損害與海馬區JNK3/ERK5差異性表達的相關研究

劉超猛，李浩浩，王梅子，張桂青

創傷后應激障礙(post-traumatic stress disorder, PTSD)是人們經歷創傷性應激事件后延遲出現和持續存在的精神障礙[1]，PTSD患者常常伴有記憶損害，可能與其記憶加工過程受阻有關[2]。作為絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信號傳導通路的重要組成部分，氨基末端激酶(jun N-terminal kinase, JNK)與壓力應激反應關系密切，JNK3信號通路可能介導了海馬神經元的凋亡進程[3]，研究[4]表明，作為MAPK家族的成員，海馬區細胞外信號調節激酶5 (extracellular signal-regulated kinase 5, ERK5)的激活對慢性壓力下大鼠的記憶損害起保護作用，目前有關PTSD樣大鼠記憶損害分子生物學方面的研究較少，該研究借助單次延長應激刺激(single prolonged stress, SPS)建立PTSD樣大鼠模型，對其記憶損害表現和不同時間點海馬區JNK3/ERK5的差異性表達做初步觀察，以進一步探討PTSD記憶損害的分子生物學機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物32只健康清潔級雄性SD大鼠，180～220 g，由新疆疾病控制動物中心[許可證號：SCXK(新)2018-0001]提供，飼養條件：室溫(25±1)℃，相對濕度50%～60%，嚴格12 h/12 h光控時間，通風良好，自由進食、飲水，無噪音環境適應性喂養5 d，實驗動物的處理遵守本單位有關開展動物實驗研究的規定。

1.2 主要試劑Anti-ERK5兔多克隆抗體、Anti-JNK3兔多克隆抗體(英國abcam公司，貨號ab196609、ab126591)；β-actin內參抗體、HPR標記羊抗小鼠二抗(武漢博士德生物工程有限公司，貨號BM0627、BA1051)；HE染色試劑盒(上海碧云天生物技術公司，貨號C0105)；定量即時聚合酶鏈反應(qRT-PCR)合成引物(北京擎科生物技術有限公司)。

1.3 模型制備按照隨機數字表法將SD大鼠分為2組：Control組8只，PTSD組24只(PTSD2 d組、PTSD5 d組和PTSD8 d組，各8只)，借鑒本課題組前期造模方法[5]，通過3個步驟建立PTSD動物模型：① 用高強度聚乙烯薄膜將大鼠完全包裹，僅在口鼻處留幾個透氣孔，2 h后去除薄膜；② 將大鼠放入25 ℃左右游泳箱中，一陣掙扎后大鼠懸停在水面，取出后用毛巾擦干；③ 將大鼠放入99.5%的無水乙醚麻醉箱中，10 s左右大鼠出現呼吸抑制，不能站立，后將其放置通風處。

1.4 模型評估建立PTSD動物模型第2天，依次通過拒縛反射測試、曠場實驗和Morris水迷宮實驗來評價兩組大鼠的恐懼反應、焦慮水平和空間記憶能力。① 拒縛反射測試：實驗人員佩戴專業手套抓取大鼠(脊柱和腹部)，觀察其行為表現(抓取不反抗0分；尖叫或回避1分；尖叫并回避2分；掙脫3分；掙脫并尖叫4分；撕咬行為5分；主動躍起攻擊6分)；② 曠場實驗：箱體(900 mm×900 mm×500 mm)底部設有16個等大方格，曠場上方連接紅外攝像儀，記錄大鼠5 min內在曠場中的站立與跨格次數；③ Morris水迷宮實驗：將大鼠置于平臺上熟悉周邊環境15 s，隨后從非靶象限面壁將其放入池內，若大鼠找到平臺則停止實驗，時間為60 s，若不能找到，引導大鼠游至水下平臺適應10 s，共重復4次，測定平均上臺潛伏期。

1.5 海馬組織提取與HE染色分別于制備PTSD大鼠模型后第2、5和8天，對PTSD2 d、5 d、8 d和Control組(第8天剝離)大鼠采用3%水合氯醛30 mg/kg行腹腔麻醉，固定大鼠剪開胸腔，從右心耳處剪開放血，隨后向大鼠心臟推注30 ml生理鹽水灌洗液，同時觀察從右心流出的液體是否清亮，后斷頭取腦，迅速剝離海馬組織，兩側海馬組織分開，一側置液氮24 h后于-80 ℃冰箱保存，另一側經10%甲醛溶液固定、酒精脫水、浸蠟包埋和切片，常規HE染色后光學顯微鏡下觀察Control組和PTSD8 d 組大鼠海馬CA1、CA3區及齒狀回(dentate gyrus, DG)組織形態變化。

1.6 qRT-PCR檢測大鼠海馬組織JNK3和ERK5 mRNA表達采用TRIzol法提取總RNA(取樣本約100 mg)，采用紫外分光光度計測量總RNA的濃度與純度，當260 nm/280 nm在1.8～2.0范圍內時，將總RNA逆轉錄成cDNA，反應條件：25 ℃，5 min；50 ℃，15 min；85 ℃，5 min；4 ℃，10 min，β-actin上游引物:5′-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3′，下游引物：5′-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3′；JNK3上游引物：5′-TGAAGAAATTGCAGCCCACC-3′，下游引物：5′-TCTTCGCTGGGTCAATCACT-3′；ERK5上游引物：5′-CTGACGATGAGCCTGATTGC-3′，下游引物：5′-TGGACACACAGGCTCACTAG-3′。將cDNA稀釋10倍行PCR檢測，反應條件：50 ℃，2 min；95 ℃，10 min；95 ℃，30 s；60 ℃，30 s，40個循環后，借助定量PCR儀(ABI7500)得出每個樣本的Ct值，實驗組JNK3和ERK5 mRNA 相對于Control組基因表達倍數采用2-ΔΔCt進行數據處理。

1.7 Western blot法檢測JNK3和ERK5蛋白表達取海馬標本100 mg，用研缽研碎，加400 μl單去污劑裂解液(含PMSF)于勻漿器中進行勻漿，然后置于冰上，裂解30 min后，將裂解液移至1.5 ml離心管中，4 ℃、12 000 r/min離心15 min后，取上清液分裝于0.5 ml離心管中，后稀釋、孵育，利用OD值測定樣本蛋白濃度，煮沸冷卻備用；制備5%的濃縮膠和12%的分離膠，上樣電泳，電泳結束，將蛋白轉膜至 PVDF 膜上，用5% 脫脂牛奶封閉2 h，孵一抗，洗膜孵二抗(HPR標記羊抗小鼠，稀釋比例為1 ∶50 000)2 h，曝光顯色，用BandScan軟件得出膠片灰度值。

2 結果

2.1 拒縛反射評分比較與Control組比較，PTSD組大鼠拒縛反射評分升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 Control組和PTSD組大鼠拒縛反射評分、 站立次數、跨格次數和上臺潛伏期的比較

P25表示第1四分位數，P50表示第2四分位數，P75表示第3四分位數

2.2 曠場實驗站立與跨格次數比較與Control組比較，PTSD組大鼠站立次數與跨格次數均減少，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.3 水迷宮定位航行能力比較在Morris水迷宮中行定位航行測試時，Control組大鼠經過短暫的調整，很快就能找到隱藏在水下20 mm的平臺，典型航行軌跡見圖1A；PTSD組大鼠更多的是圍繞著迷宮內壁打轉，見圖1B；與Control組比較，PTSD組大鼠平均上臺潛伏期延長，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

圖1 Control組和PTSD組大鼠在水迷宮中航行示意圖A: Control組; B:PTSD組

2.4 海馬組織HE染色結果與Control組大鼠海馬組織CA1區和CA3區比較，PTSD8 d組CA1區和CA3區海馬神經元排列紊亂，結構異常，染色不均，且胞核和胞質界限較模糊，見圖2A、2B、2D、2E；與Control組大鼠海馬組織DG區相比，PTSD8 d組DG區海馬神經元排列紊亂，結構異常，神經元數量大量減少，胞核和胞質界限模糊，見圖2C、2F。

2.5 大鼠海馬組織JNK3/ERK5 mRNA水平表達4組大鼠海馬組織JNK3/ERK5 mRNA 水平表達存在差異(F=7.42,P<0.05;F=16.33,P<0.05)。與Control組(0.123±0.016)相比，PTSD2 d組(0.212±0.056)、PTSD5 d組(0.188±0.033)大鼠海馬組織JNK3 mRNA表達升高，差異有統計學意義(P<0.05)，PTSD8 d組(0.134±0.025)與Control組相比，JNK3 mRNA表達差異無統計學意義(P>0.05)，PTSD2 d、5 d和8 d組JNK3 mRNA表達量呈下降趨勢，各組間差異均有統計學意義(P<0.05)；與Control組(0.135±0.033)比較，PTSD2 d組(0.204±0.048)、PTSD5 d組(0.290±0.045)和PTSD8 d組(0.377±0.059)大鼠海馬組織ERK5 mRNA的表達升高，且依次增多，各組間差異均有統計學意義(P<0.05)。

2.6 大鼠海馬組織JNK3/ERK5蛋白水平表達Western blot實驗結果表明， PTSD2 d組、PTSD5 d組JNK3蛋白表達較Control組升高，差異有統計學意義(P<0.05)，PTSD8 d組與Control組相比，JNK3 蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)；PTSD2 d、5 d和8 d組ERK5蛋白表達較Control組升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3。

3 討論

PTSD的一個重要特征在于其對學習記憶能力的破壞，學習記憶能力受損又加重了其恐懼和焦慮樣表現[6]。在本次研究中，與Control組大鼠比較，PTSD組大鼠拒縛反射評分增高，表明其恐懼反應明顯；在曠場實驗中的站立和跨格次數減少，表明其自主探索欲望減退，意志活動減弱，情緒喚醒水平降低，而情緒喚醒水平的高低與記憶的效果密切相關[7]；在Morris水迷宮中平均上臺潛伏期延長，表明其空間記憶能力減退；HE染色后PTSD組大鼠海馬組織CA1、CA3和DG區神經元排列紊亂，結構異常，特別是DG區，神經元數量大量減少，表明經歷復合應激后，PTSD大鼠海馬神經元排列已經偏離了其獨特的高度有序的板層構筑結構。本研究通過束縛、強制游泳和乙醚麻醉等方式成功制備了具有恐懼、焦慮等情緒記憶和空間記憶能力受損類似臨床上PTSD患者核心癥狀的大鼠模型，達到了以往課題組有關PTSD大鼠模型制備標準[5]。

圖2 大鼠海馬組織HE染色情況 ×400

A～C：分別為Control組大鼠海馬組織CA1、CA3和DG區示意圖；D～F：分別為PTSD8 d 組大鼠海馬組織CA1、CA3和DG區示意圖

圖3 大鼠海馬組織 JNK3和ERK5的表達

1:Control組;2:PTSD2 d組;3:PTSD5 d組;4:PTSD8 d組;與Control組比較:*P<0.05

海馬體是學習與記憶的樞紐，主要負責長時程記憶的存儲與轉換。學習記憶又與神經系統蛋白質受體、神經遞質代謝水平密切相關[8]，JNK信號通路，由JNK1、JNK2和JNK3組成，而JNK3僅在中樞神經系統特異性表達，激活后的JNK借助Bcl-2、Caspase-3等信號通路介導神經細胞的凋亡進程[9]，Kuan et al[10]研究表明，抑制JNK3基因的活化轉錄能有效提高神經細胞的生存率。本次研究觀察了建立PTSD模型后大鼠1周內3個時間點海馬組織中JNK3 mRNA及蛋白的動態變化，相比于Control組，PTSD2 d 組和5 d 組JNK3 mRNA及蛋白表達均升高，這與田和平 等[11]研究結果類似，可能是創傷早期大鼠海馬區JNK3的大量表達介導了神經細胞的損傷和凋亡過程；值得注意的是，從PTSD第2、5和8天整個時間軸來看，JNK3 mRNA及蛋白表達呈現了一個增多漸緩的趨勢，與Control組比較，PTSD8 d組大鼠海馬組織JNK3 mRNA及蛋白的表達差異已無統計學意義，可能是海馬區神經細胞的大量損傷與凋亡激活了大鼠相關腦區的神經保護通路，減少了JNK3 mRNA及蛋白的表達。

Su et al[12]研究表明，ERK5可通過調控過氧化氫和神經生長因子的表達來介導神經細胞的“預處理”保護機制，Akyol et al[13]研究顯示，ERK5可通過激活原肌球蛋白受體激酶C(TRKC)來介導神經營養因子3(NT-3)對腦損傷大鼠神經功能的改善作用，以上均說明ERK5在神經系統損傷進程中起介導保護作用。在本次研究中，相比于Control組，PTSD2 d、5 d和8 d 組大鼠海馬組織ERK5 mRNA及蛋白表達水平逐步升高，而神經細胞凋亡介導因子JNK3的表達逐漸減少，故ERK5可能是通過抑制JNK3的表達來發揮神經細胞損傷保護作用的。

由于雌鼠在其性周期內激素水平變化會對JNK3/ERK5的表達產生影響，所以本研究全部選用雄性SD大鼠，但限于條件，未能觀察到JNK3與ERK5在各自上下游調控通路中是如何發揮作用的，較小的樣本量可能對研究結論也有一定影響，這也為下一步的研究提供了方向。