白藜蘆醇減輕高脂飲食小鼠腎損傷的作用及機制

許 伶，凌夢玉，陳 超，呂正梅

隨著生活方式的改變，高脂飲食、缺少運動等不健康生活方式引起的肥胖相關疾病發病率逐年升高。脂質代謝紊亂是許多原發性和繼發性腎臟疾病的共同特征之一[1]。當機體出現脂質代謝紊亂時，會導致腎臟內的脂質沉積，進而進展為腎損傷。國內外圍繞脂質代謝紊亂引發的慢性腎損傷的研究越來越多，但對其治病機制仍不十分明確。白藜蘆醇(resveratrol，RSV)是多酚類化合物。目前已經證實其具有抗炎、抗氧化的作用，具有保護心臟和腦缺血以及抗腫瘤作用[2]。近年來，研究[3-4]表明其還具有腎臟保護作用。目前研究顯示RSV可以通過激動沉默信息調節因子2相關酶1(silent information regulator factor 2 related enzyme 1，SIRT1)信號通路發揮保護作用[5]；抑制炎性因子白介素6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)或減少一氧化氮(nitric oxide，NO)釋放，減輕腎臟炎性狀態[6]。但RSV如何發揮腎臟保護作用的機制尚不明確。該研究探索RSV減輕高脂飲食引起腎損傷的作用及機制具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 實驗動物造模6周齡雄性C57BL/6J小鼠，SPF級，體質量18～20 g，購自安徽醫科大學實驗動物中心。將實驗小鼠分為3組：正常對照組(control，CTRL組)、高脂組(high lipid，HL組)、RSV干預組(RSV組)。CTRL組：普通飼料喂養；HL組：高脂飼料(1%膽固醇、10%豬油、10%蛋黃粉、20%蔗糖、59%維持料)喂養；RSV組：高脂飼料同HL組，并以RSV 5 mg/(kg·d) 灌胃，RSV購自南京澤朗植提技術有限公司，每周稱量小鼠體質量，根據體質量調整RSV用量。

1.2 血脂檢測18周后實驗結束，摘除小鼠眼球收集血液，取血清測血脂(日本OLYMPUS AU640全自動生化分析儀)、腎功能。

1.3 腎組織學觀察各組腎組織制作5 μm厚石蠟切片，常規HE染色、PAS染色，在普通光學顯微鏡下觀察腎臟組織病理變化。

1.4 免疫組織化學染色取各組腎組織石蠟切片，常規脫蠟至水，枸櫞酸鹽修復，3% H2O2孵育阻斷內源性過氧化物酶(武漢博士德生物工程有限公司)，正常山羊血清封閉；加抗纖維黏連蛋白(fibronectin,FN)抗體(1 ∶200)(美國proteintech公司)，4 ℃ 孵育過夜；羊抗兔IgG(武漢博士德生物工程有限公司)工作液37 ℃ 孵育1 h；SP工作液(北京中杉金橋生物技術有限公司)37 ℃孵育30 min；DAB顯色(北京中杉金橋生物技術有限公司)，脫水、透明、封片。以PBS代替一抗作陰性對照。

1.5 Western blot取約50 mg腎組織，加入RIPA裂解液(含PMSF，100 ∶1)充分勻漿，BCA法定量測定蛋白濃度。等量蛋白上樣后12%SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白后恒流轉至PVDF膜，室溫5%脫脂牛奶封閉1 h，一抗葡萄糖調節蛋白78(glucose regulated protein 78，GRP78)(1∶1 000)、谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4，GPx4)(1∶1 000)、超氧化物歧化酶2(superoxide dismutase 2，SOD2)(1∶1 000)、SITR1(1∶1 000)均購自美國CST公司，GAPDH抗體(美國Proteintech公司)4 ℃ 孵育過夜，洗膜后37 ℃ 二抗(1∶10 000)孵育1 h；TBST洗膜后，現配顯影液，上海培清科技有限公司ECL曝光機曝光，保存圖片。實驗結果用Gel-ProAnalyzer軟件進行分析。

1.6 RT-PCR取腎臟組織約50 mg，TRIzol(大連寶生生物工程有限公司)勻漿后酚-氯仿法提取總RNA。用TaKaRa公司5×PrimeScript RT Master Mix進行逆轉錄反應。TaKaRa公司Premix TaqTM(TaKaRa TaqTMVersion 2.0 plus dye)進行cDNA樣品擴增，瓊脂糖凝膠電泳，上海培清科技有限公司凝膠成像儀拍照，凝膠成像系統SensiAnsy分析處理。引物序列見表1。

表1 RT-PCR的引物序列

2 結果

2.1 3組體質量、血脂和腎功能比較HL組與CTRL組相比，體質量增加(P<0.05)，高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)下降，低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)增高(P<0.05)，總膽固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglyceride，TG)和尿酸(uric acid，UA)水平增高(P<0.05)；RSV組與HL組相比，血脂水平HDL-C升高，LDL-C下降，TC、TG和UA水平下降，差異有統計學意義(P<0.05)。血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、肌酐(creatinine，CRE)差異無統計學意義。見表2。

表2 各組小鼠體質量、血脂、腎功能比較

與CTRL組比較：*P<0.05；與HL組比較：#P<0.05

2.2 3組腎臟組織學變化HE染色顯示CTRL組小鼠腎組織結構基本正常。HL組小鼠腎小球系膜細胞和基質稍增多，偶見節段性腎小球硬化，腎小管間質纖維化，可見間質細胞增多，炎癥細胞浸潤；腎小管上皮細胞淡染，胞質增多。RSV組腎小球面積略有縮小，系膜增生明顯減輕。表明RSV可以改善高脂飲食誘導的慢性腎臟損傷，見圖1。PAS染色顯示正常組小鼠腎組織結構基本正常，少量紅染，高脂組小鼠腎小球糖原沉積增多見明顯紅染區，RSV組腎小球紅染明顯變淡，見圖2。

圖1 各組腎臟組織病理改變 ×200A：CTRL 組；B：HL組；C：RSV組

圖2 各組腎臟組織PAS染色改變 ×400A：CTRL 組；B：HL組；C：RSV組

圖3 各組腎臟組織FN表達免疫組化染色 ×400A：CTRL組；B：HL組；C：RSV組

圖4 Western blot法檢測各組腎組織GRP78、GPx4、SOD2、SIRT1蛋白水平與CTRL組比較：*P<0.05；與HL組比較：#P<0.05

2.3 3組小鼠腎組織FN的表達免疫組化結果顯示FN主要在腎小體細胞間質表達，CTRL組和RSV組小鼠腎組織呈弱陽性表達，HL組表達增加，陽性染色呈棕黃色。見圖3。

2.4 3組小鼠腎組織GRP78、GPx4、SOD2和SIRT1蛋白表達與CTRL組比較，HL組腎組織抗氧化相關蛋白GPx4、SOD2、SIRT1表達水平明顯下調(P<0.05)，內質網應激分子標志物GRP78的蛋白表達上調；與HL組比較，RSV組抗氧化相關蛋白GPx4、SOD2、SIRT1的表達上調，內質網應激分子標志物GRP78蛋白的表達下調(P<0.05)。見圖4。

2.5 3組腎臟組織中GRP78和CHOP mRNA表達與CTRL組比較，HL組腎組織GRP78和CCAAT增強子結合蛋白的同源蛋白(CCAAT/enhancer binding protein-homologous protein，CHOP)mRNA表達明顯上調(P<0.05)；而與HL組比較，RSV組腎組織GRP78和CHOP mRNA表達水平均明顯下調(P<0.05)。見圖5。

圖5 RT-PCR法檢測各組腎組織GRP78和CHOP mRNA 水平

M：Marker；與 CTRL組比較：*P<0.05；與HL組比較：#P<0.05

3 討論

肥胖對健康的影響日益嚴重，在發展中國家也變得越來越普遍。近年來，較多的研究[7]表明肥胖與腎功能障礙之間有密切的關系。目前研究[8]顯示，脂質代謝紊亂是慢性腎臟病進展的危險因素。本實驗結果顯示，經過18周的高脂飼料喂養后，HL組小鼠的體質量明顯高于CTRL組；血清中TC、TG和UA水平高于CTRL組；HL組小鼠HE染色、PAS染色和FN免疫組化結果證實，腎組織存在損傷性改變。提示高脂飲食可誘導小鼠的脂質代謝紊亂，可能通過多種途徑，對腎小球內皮細胞、系膜細胞造成損傷，引起系膜增生，細胞外基質增厚，糖原沉積，腎小球硬化和間質纖維化，進而損傷其腎功能。有臨床研究[9]顯示慢性腎功能障礙和血脂異常進展之間的密切關系。研究[10]表明，高三酰甘油血癥可促進LDL沉積并降低HDL水平，增加慢性腎病進展風險。

雖然脂質介導的腎損傷初始機制尚不清楚，但目前認為氧化應激、內質網應激以及炎癥反應是參與脂質介導腎損傷的主要機制[11]。研究[12]表明高脂血癥能增加單核細胞活性氧(reactive oxygen species，ROS)的生成速率，它是一種內皮損傷的重要因子，隨著ROS生成增多，觸發氧化應激反應，致使內皮細胞損傷嚴重，這可能是脂質誘導腎損傷的重要機制。哺乳動物在呼吸和新陳代謝過程中產生的很多ROS由體內的自由基清除劑和抗氧化酶進行清除。抗氧化劑SOD2是重要的超氧化物歧化酶；GPx4是催化氧化氫轉化為水的另外一種抗氧化物酶。SIRT1是一種NAD+依賴的蛋白去乙酰基酶，可調節細胞內的代謝，誘導ROS的凋亡，抑制氧化應激。研究[13]已經證實SIRT1在腎損傷中的重要作用，無論是糖尿病腎病、急性腎損傷激活SIRT1都能夠抑制腎損傷的進展。本實驗研究也表明，與CTRL組比較，HL組腎組織SIRT1、SOD2和GPx4蛋白表達明顯下調；與HL組比較，RSV組能夠上調腎組織GPx4和SOD2蛋白的表達，RSV作為SIRT1的激動劑，則使SIRT1蛋白表達明顯上調。

氧化應激雖然目前被認為是多種疾病致病的重要環節，而任何干擾氧化還原的調控都能夠導致內質網應激，有研究[14]指出內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)可通過未折疊蛋白反應(unfolded protein response，UPR)以及與線粒體之間的相互作用產生過多的ROS，誘導局部組織和細胞的氧化應激(oxidative stress，OS)。GRP78和CHOP是內質網應激和UPR激活的標志，CHOP是促凋亡UPR的反應基因，在內質網應激參與急性腎小管壞死和急性腎損傷機制中發揮重要作用。本實驗發現，與CTRL組比較，HL組腎組織CHOP和GRP78 mRNA水平表達上調，以及GRP78的蛋白表達也明顯上調。而與HL組比較，RSV組顯著下調腎組織CHOP和GRP78 mRNA的表達水平，下調GRP78的蛋白表達。

研究[6]顯示，RSV具有較強的清除自由基和抗脂質過氧化功能，可控制高熱量飲食引起的動物體質量增加，增強脂蛋白的抗氧化能力，改善血管內皮功能，降低LDL、TC水平。因此RSV可能通過調節脂質代謝紊亂清除過多的ROS和改善與高脂相關的OS、ERS；改善腎臟上皮細胞線粒體結構和功能的損傷，從而發揮對腎臟的保護作用。

本課題闡明了長期高脂飲食導致的腎組織損傷和腎功能下降的分子機制及RSV通過減輕腎組織氧化應激和內質網應激等機制發揮保護作用機制，為慢性腎損傷治療方法提供了新的思路。