青蒿素對肝癌細胞基因表達譜的影響

王惠國，蔡 珂，，韓鑫龍，，李雨桐，，袁立霞，譚曉梅,4，湯慶發,4，邢學鋒,4，陳飛龍,4，吳長清，唐 玲,4

肝癌細胞(hepatocellular carcinoma，HCC)是最常見的惡性腫瘤之一，占原發性肝癌的90%[1]。盡管新型治療法和診斷技術取得了巨大的成就，但早期發現HCC很困難，導致HCC患者5年生存率較低(0～14%)[1]。因此，發現能夠鑒定HCC的特異和敏感的生物標志至關重要。青蒿是一種重要的中草藥植物，從青蒿草本植物中提取的青蒿素是抗瘧疾藥物的有效成分。近年來，已報道了青蒿素的其他功能[2]。最近青蒿素作為抗癌劑由其臨床安全性和廣泛的功效而受到廣泛關注。

在肝細胞癌中，miRNA經常呈現異常的表達譜，這使得其對于診斷或預后應用具有潛在的吸引力。該研究通過RNA-Seq技術，分析在青蒿素藥物作用下，肝癌細胞中miRNA表達譜變化，發現與調控肝癌增殖有關的miRNA，為青蒿素在肝癌治療策略發展中奠定基礎。

1 材料與方法

1.1.1實驗細胞 肝癌細胞HepG2、Huh7購自美國ATCC細胞庫。

1.1.2實驗藥物 青蒿素購自美國Sigma公司(規格：361593-100 MG)；在二甲基亞砜(DMSO)中制備青蒿素的儲備溶液； DMSO的最終濃度保持低于0.01%。

1.1.3實驗試劑與器材 DMEM培養基購自美國Gibco公司；RNAiso plus、Premix TaqTM、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)均購自日本TaKaRa公司；AMOAF1000自動細胞計數儀購于美國Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養與實驗分組 人肝癌細胞HepG2、Huh7，在含有10% FBS和1%青霉素、1%鏈霉素的培養液(DMEM培養液)于37 ℃、5% CO2的培養箱中進行培養。細胞狀態良好并生長至對數期時，進行實驗處理，每組重復6個孔。

1.2.2Cell Viability Assay法測定細胞增殖 以每孔3 000個細胞，將HepG2和Huh7細胞接種到96孔板，加入完全培養基中并使其附著過夜。第2天加入青蒿素(0、50、100、150、200 μmol/L)處理24、48 h。每個孔中加入20 μl CellTiter-Blue?Luminescent Cell Viability Assay。使用Bio-Rad細胞成像檢測儀測量Luminescent的吸光度值。

1.2.3結晶紫實驗測定細胞增殖 將HepG2和Huh7細胞接種到12孔板，加入完全培養基中并使其附著過夜(每孔2 000個細胞)。第2天加入青蒿素(0、100 μmol/L)處理7 d。用PBS清洗2遍，每孔加入500 μl的結晶紫溶液，搖床孵育30 min后，PBS清洗3次，每孔加入10%冰醋酸溶液1 ml，搖床孵育10 min后，每孔取等量的溶液入96孔板中，測取550 nm吸光度值。

4.5 通過試驗篩選出高效低毒低殘留的農藥 使用化學農藥上要疏堵結合，疏就要給煙農提供可使用的化學農藥。通過開展試驗篩選出適用于煙葉病蟲害防治的高效低毒低殘留的農藥品種，煙草公司統一采購、統一管理，煙農可以在煙草公司選購到合適的防治農藥品種，避免煙農在市場上盲目購買高毒高殘留農藥，而且有利于管理，對形成以“技術、信息、咨詢、物資供應”等一條龍服務打下基礎。堵就是要禁止煙農使用高毒、高殘留、易超限的農藥品種，經檢測發現使用者將影響其煙葉被收購等級和來年種植合同簽訂面積。

1.2.4肝癌細胞總RNA提取、文庫構建與測序 收集藥物處理24 h的肝癌細胞，細胞進行消化處理，離心后棄上清液加入PBS清洗2遍后，加入1 ml的RNAiso Plus，室溫靜置5 min，加入200 μl氯仿并振蕩混勻，室溫靜置5 min，離心5 min(10 360 r/min，4 ℃)。將上清液轉移至新的離心管中且加入等體積的異丙醇，室溫靜置10 min，離心10 min(10 360 r/min、4 ℃)。棄上清液，加入1 ml的75%乙醇清洗沉淀，離心5 min(10 360 r/min，4 ℃)。收集沉淀，并自然干燥，溶解于適量的DEPC處理水中。用帶有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA，在得到的mRNA中合成cDNA，再經瓊脂糖凝膠電泳回收目的大小片段，并進行PCR擴增，從而完成整個文庫制備工作，構建好的文庫用Illumina HiSeq 2500進行測序。

1.2.5novel miRNA的預測 miRNA前體的標志性發夾結構，能夠用來預測新的miRNA。整合miREvo和mirdeep 2這些miRNA預測軟件來進行新miRNA的分析，基本原理是通過截取一定長度sRNA比對上的參考序列，通過探尋其二級結構及Dicer酶切位點信息、能量等特征進行分析，預測樣品中novel miRNA，并進行各樣本中匹配上的sRNA的序列、長度、出現的次數等信息，以及不同長度miRNA的首位點堿基分布和所有miRNA的各位點堿基分布情況的統計。

1.2.6差異表達miRNA和靶基因的鑒定 對各樣本中已知和新miRNA進行表達量的統計，并用DEGseq軟件進行差異表達分析，在獲得差異表達的miRNA中挑選顯著性高表達和低表達的miRNA，用miRanda、PITA和RNAhybrid三個軟件的交集預測miRNA靶基因。由于每個miRNA鑒定到的靶基因較多，只挑選分值小于-1.2，且能量值小于7的。用火山圖可以推斷差異miRNA的整體分布情況，從差異倍數(fold change)和校正后的顯著水平(padj/qvalue)兩個方面進行評估，對差異miRNA進行篩選。橫坐標代表miRNA在不同實驗組中/不同樣品中表達倍數變化，縱坐標代表miRNA表達量變化的統計學顯著程度，圖中的散點代表各個miRNA，藍色圓點表示無顯著性差異的miRNA，紅色圓點表示顯著上調的差異miRNA，綠色圓點表示顯著下調的差異miRNA。

1.2.7差異miRNA靶基因富集分析 京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)富集程度通過Rich factor、Qvalue和富集到此通路上的基因個數來衡量。其中Rich factor指差異表達的基因中位于該pathway條目的基因數目與所有有注釋基因中位于該pathway條目的基因總數的比值。Rich factor越大，表示富集的程度越大。Qvalue是做過多重假設檢驗校正之后的Pvalue，Qvalue的取值范圍為(0，1)，越接近于零，表示富集越顯著。

2 結果

2.1 青蒿素對人肝癌細胞HepG2、Huh7增殖的抑制作用Cell Viability實驗結果顯示，青蒿素對HepG2、Huh7兩種肝癌細胞有增殖抑制作用且呈現量效、時間依賴性，差異有統計學意義(P<0.05)。青蒿素對肝癌細胞的增殖有明顯的抑制作用，且青蒿素濃度100 μmol/L在24 h時就具有明顯的抑制效果，見表1、2。細胞克隆實驗結果表明，濃度100 μmol/L青蒿素對人肝癌細胞HepG2的抑制率為(21.93±6.90)%，對Huh7的抑制率為(52.59±3.63)%，有明顯的抑制效果且差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1。根據實驗結果，選擇青蒿素藥物濃度100 μmol/L，藥物作用時間24 h用于后續實驗研究。

表1 青蒿素對人肝癌細胞HepG2增殖作用的抑制率

與青蒿素組0 μmol/L比較：*P<0.05；與24 h作用時間點比較：#P<0.05

表2 青蒿素對人肝癌細胞Huh7增殖作用的抑制率

與青蒿素組0 μmol/L比較：*P<0.05；與24 h作用時間點比較：#P<0.05

圖1 青蒿素對肝癌細胞克隆形成能力的影響與對照組比較：**P<0.01，****P<0.000 1

2.2 microRNAs 二代測序數據分析

2.2.1Noverl miRNA預測 在HepG2和Huh7兩種肝癌細胞中，加入100 μmol/L濃度的青蒿素，作用24 h，其細胞內的miRNA與對照組相比，整合miREvo和mirdeep2這些miRNA預測軟件來進行新miRNA的分析，分析得到10種新的miRNA。在二級結構示意中，整個序列是miRNA前體，紅色突出部分為Noverl miRNA的成熟體序列。見圖2。

2.2.2差異表達miRNA基因的篩選和靶基因的富集分析 在100 μmol/L青蒿素作用24 h后，與對照組相比較。HepG2細胞系中，篩選出上調miRNA基因43條，下調基因41條；Huh7細胞系中，刷選出上調miRNA基因13條，下調基因9條，見圖3。在上調和下調的miRNA中，篩選出顯著上調和顯著下調的miRNA，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖4。兩種細胞系中，相同的差異miRNA有4個，分別是hsa-miR-32-5p、hsa-miR-30e-5p、hsa-miR-22-3p和hsa-miR-1307-3p，見圖5。

圖2 預測Novel miRNA的結構

圖3 差異miRNA火山圖 A：HepG2;B:Huh7

圖4 HepG2和Huh7細胞中顯著變化的miRNA

A：HepG2和Huh7細胞中顯著上調的miRNA；1：hsa-miR-199a-5p；2：Novel_1144；3：Novel_1213；4：hsa-miR-4426；5：hsa-miR-1273g-3p；6：hsa-miR-451a；7：hsa-miR-556-5p；8：hsa-miR-33a-5p；9：hsa-miR-182-3p；10：hsa-miR-328-3p；B：HepG2和Huh7細胞中顯著下調的miRNA；1：hsa-miR-4664-5p；2：hsa-miR-195-3p；3：hsa-miR-1276；4：hsa-miR-3679-5p；5：hsa-miR-4454；6：hsa-miR-10b-3p；7：hsa-miR-4671-5p；8：hsa-miR-1247-3p；9：hsa-miR-1269b；10：hsa-miR-1246

圖5 HepG2和Huh7細胞中相同的差異miRNA

在HepG2和Huh7細胞系中，挑選了富集前20位的pathway條目在圖6和圖7中進行展示。在這些通路中，與HepG2細胞相關的為Rap1信號通路，與Huh7細胞相關的為MAPK信號通路。

圖6 HepG2細胞候選靶基因KEGG富集散點圖

圖7 Huh7細胞候選靶基因KEGG富集散點圖

3 討論

肝細胞肝癌是肝臟最常見的惡性腫瘤之一，是世界死亡率第二的癌癥，嚴重威脅著人們健康[3]。肝癌起病隱匿，早期沒有癥狀或癥狀不明顯，不易被發現，僅40%患者能在早期被發現。但肝癌發生迅速，大多數患者確診時已經達到局部晚期或發生遠處轉移，治療困難，預后很差，嚴重威脅著人們的健康。肝癌的發生是復雜的過程，外界刺激導致肝細胞遺傳性改變，使其增殖、凋亡、結構等發生異常，導致癌癥的發生。通過對肝癌發生分子機制的研究，可能為肝癌臨床治療提供新的方法，也是肝癌治療的理論基礎[4]。

miRNA是短小的、非編碼RNA，通常由1～22個核苷酸組成。目前已發現超過2 500種人miRNA在各種生理和病理過程中發揮重要作用。例如胚胎發育、細胞增殖、分化、細胞周期進程、細胞凋亡、自噬、血管生成和代謝[4]。最近，已經證明miRNA在人類癌癥中表現出組織和疾病特異性模式，表明miRNA可能是用于HCC的早期診斷和預后預測的新型生物標志物[5]。

青蒿是一種使用了2 000多年的傳統藥物，對瘧疾、寄生蟲病和纖維化具有顯著的療效，且毒性低[2]。最近幾年被報道出具有廣泛的抗腫瘤活性，但在肝癌細胞上研究較少。本研究表明青蒿素能夠抑制肝癌細胞Huh7和HepG2的增殖，且隨著藥物濃度增大，抑制作用隨之增強；在同一藥物濃度下，隨著時間的延長抑制作用也越強。說明青蒿素在肝癌細胞中是有一定的研究價值。

本研究利用高通量測序技術對青蒿素作用于兩種肝癌細胞Huh7和HepG2 中的miRNA進行測序并分析了差異表達miRNA，其中肝癌細胞Huh7篩選出21個差異表達的miRNA，肝癌細胞HepG2篩選出84個差異表達的miRNA，兩種肝癌細胞相同的差異表達miRNA共有4個，分別是miR-32-5p、miR-30e-5p、miR-22-3p和miR-1307-3p，這4個miRNA可能與青蒿素抑制肝癌細胞增殖有密切關系。研究[6]表明，miR-32-5p在腫瘤中異常表達并發揮重要的調節作用，且與膀胱腫瘤的癌癥特異性存活密切相關。Chen et al[7]發現，miR-30e-5p與miR-15a一起抑制LRP6的表達并促進GMEC中的脂肪代謝。Chen et al[8]將miR-22-3p鑒定為腫瘤抑制因子，其直接靶向SP1以抑制細胞增殖并誘導HCC中的細胞周期停滯和細胞凋亡。Chen et al[9]發現miR-1307-3p的表達可能被認為是結腸癌患者5-FU化療療效的預測因子。

近幾年，已經證明miRNA涉及許多類型的疾病，尤其是人類惡性腫瘤。許多miRNA在HCC中失調，這可能對當前的研究有所啟發。由于miRNA穩定且易于檢測，因此在肝癌組織、血清/血漿和細胞系中報道了它們的異位表達。對于miRNA在肝癌作用機制的研究仍然在不斷擴展。本研究通過靶基因預測并進行功能分析，結果顯示青蒿素在HepG2細胞中主要調控Rap1信號通路，在Huh7細胞主要調控MAPK信號通路，暗示著青蒿素在不同肝癌細胞中的作用機制各有不同。有研究表明，Rap1的下調能夠誘導肝癌細胞HepG2凋亡[10]，且Rap1還可以抑制肝癌細胞的生長和侵襲[11]。MAPK通路聯合ERK通路[12]或者RAS通路[13]可以作為肝癌細胞生長的預后標志物。基于大量文獻報道，可推測Rap1信號通路和MAPK信號通路在青蒿素抑制肝癌細胞生長過程中發揮了重要的作用。本研究中，大量基因指向多種通路，但具體哪條通路指向青蒿素調控肝癌細胞生長仍需進一步研究。

本研究評估了在青蒿素作用下HCC中失調的miRNA的最新數據，在肝癌細胞Huh7中篩選出21個差異表達的miRNA，在肝癌細胞HepG2中篩選出84個差異表達的miRNA，兩種肝癌細胞相同的差異表達miRNA共有4個，并回顧了這些miRNA的報道功能和對靶基因預測進行理論分析，推測它們很有可能適用于青蒿素調控miRNA治療肝癌的診斷、治療和預后標志物。