冠心病EAT中miR-455b-3p調(diào)控脂肪細(xì)胞分化及炎癥因子

杜雅彥，劉 洋，盧 沐，懷施濤，呂作利，魏育濤

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(coronary artery disease，CAD)是歐洲發(fā)達(dá)國(guó)家導(dǎo)致死亡的主要因素[1]。隨著經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)，發(fā)展中國(guó)家的心血管疾病數(shù)量也在增加。心外膜脂肪組織(epicardial adipose tissue，EAT)是一種沉積在心肌表面獨(dú)特的內(nèi)臟脂肪組織[2]，能分泌脂聯(lián)素(adiponectin，APN，ADIPOQ)等脂肪細(xì)胞因子，可能會(huì)對(duì)心臟功能產(chǎn)生影響，但EAT啟動(dòng)炎癥發(fā)生的機(jī)制并不十分明確。微小RNA(microRNA, miRNA)是一類大小約22個(gè)核苷酸的單鏈非編碼RNA[3]，通過與靶基因互補(bǔ)位點(diǎn)結(jié)合的方式來調(diào)控基因表達(dá)，調(diào)控多種疾病發(fā)生和發(fā)展。miRNAs在CAD發(fā)病機(jī)制的各個(gè)環(huán)節(jié)中都有作用，但其對(duì)CAD發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制尚不明確。該實(shí)驗(yàn)通過芯片篩選結(jié)果顯示，在CAD 患者EAT中，miR-455b-3p高表達(dá)。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，miR-455b-3p與APN靶向結(jié)合。該研究以miR-455b-3p為切入點(diǎn)，探討miR-455b-3p對(duì)脂肪細(xì)胞分化及脂肪細(xì)胞因子表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 病例資料收集2016年3月～2017年6月在石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院心胸外二科行冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)的CAD患者34例作為實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組為行瓣膜置換術(shù)的非冠心病(non-CAD)患者16例。手術(shù)前收集所有研究對(duì)象的一般資料和化驗(yàn)檢查資料。實(shí)驗(yàn)組符合CAD的診斷標(biāo)準(zhǔn)及納入標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)照組冠狀動(dòng)脈造影陰性，需行瓣膜置換手術(shù)(瓣膜為退行性變)且符合納入標(biāo)準(zhǔn)。本研究通過新疆石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(編號(hào)：2014-072-01)，所有研究對(duì)象簽署知情同意書。

1.2 主要試劑3T3-L1前體脂肪細(xì)胞(中科院上海細(xì)胞庫(kù))；引物及內(nèi)參(上海生工公司)；miRNA模擬物及抑制物(上海吉瑪制藥公司)；RNA提取試劑和 qRT-PCR反應(yīng)試劑盒(日本TaKaRa公司)；胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)；DMEM培養(yǎng)基及胰蛋白酶(美國(guó)Hyclone公司)；TRIzol、LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑(美國(guó)Invitrogen公司)；miRNeasy miRNA提取試劑盒(德國(guó)Qiagen公司)；Thermo Scientific miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒、miRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒(北京天根生化科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照我國(guó)衛(wèi)生部發(fā)布的《冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的診斷標(biāo)準(zhǔn)》(2010年版)以及2011年美國(guó)心臟聯(lián)合會(huì)(American Heart Association，AHA)冠心病診療指南。

1.3.2納入標(biāo)準(zhǔn) 實(shí)驗(yàn)組：① 年齡40～75(63.8±4.2)歲；② 符合CAD的診斷標(biāo)準(zhǔn)需行冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)患者；③ 民族為漢族。對(duì)照組：① 年齡40～75(66.5±7.3)歲；② 冠狀動(dòng)脈造影陰性且需行瓣膜置換手術(shù)(瓣膜為退行性變)患者；③ 民族為漢族。

1.3.3排除標(biāo)準(zhǔn) ① 合并有糖尿病或糖耐量異常者；② 其他類型心臟病，如風(fēng)濕性心臟病患者；③ 患有惡性腫瘤者；④ 近期有創(chuàng)傷、外科手術(shù)者；⑤ 急、慢性感染者；⑥ 長(zhǎng)期肝、腎等臟器疾病及其他內(nèi)分泌疾病。

1.3.4收集臨床資料 包括患者年齡、性別、身高、體質(zhì)量、病程、大生化、心肌酶、超敏C反應(yīng)蛋白、心臟彩超及頸動(dòng)脈彩超等。

1.3.5標(biāo)本采集 留取手術(shù)當(dāng)天空腹臥位肘靜脈血5 ml，留取血清-80 ℃冰箱保存。開胸后獲取右室表面EAT約1 g，0.9%氯化鈉溶液清洗并去除結(jié)締組織后置于液氮中保存。在所有收集實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組標(biāo)本中各挑選5例患者的EAT用于miRNA芯片檢測(cè)，由上海伯豪生物芯片技術(shù)有限公司技術(shù)人員完成Agilent miRNA芯片檢測(cè)。[Agilent human miRNA(8*60 K)V18.0 Design ID：70156]同步取患者循環(huán)血約5 ml，3 000 r/min離心10 min，取上層血漿至無(wú)酶EP管中，并置于-80 ℃冰箱中暫時(shí)凍存。

1.3.6EAT標(biāo)本基因芯片檢測(cè) ① RNA抽提和純化：采用mirVanaTMPARISTM標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行樣品總RNA抽提，抽提所得total RNA經(jīng)電泳質(zhì)檢合格后備用；② RNA的標(biāo)記：標(biāo)本RNA按照 miRNA Complete Labeling and Hyb Kit標(biāo)準(zhǔn)操作流程對(duì)miRNA分子進(jìn)行熒光標(biāo)記；③ 芯片雜交：按照miRNA Complete Labeling and Hyb Kit進(jìn)行標(biāo)本雜交實(shí)驗(yàn)。在滾動(dòng)雜交爐中，55 ℃，20 r/min，滾動(dòng)雜交20 h之后在洗缸中洗片；④ 芯片掃描：芯片結(jié)果采用Agilent Microarray Scanner進(jìn)行掃描，軟件設(shè)置Scan resolution=5 μm，PMT 100%，5%最后采用 Gene Spring Software 11.0 進(jìn)行歸一化處理，所用的算法為Quantile；⑤ 差異表達(dá)：CAD組和non-CAD組間差異表達(dá)的miRNAs采用SAS 系統(tǒng)進(jìn)行篩選[設(shè)定篩選閾值P<0.05，差異倍數(shù)值(fold change)>2且Flag值/Call值為至少一組內(nèi)不出現(xiàn)A(Absent:表示差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義) ]。

1.3.7細(xì)胞培養(yǎng)與誘導(dǎo)分化 在6孔板中將3T3-L1前脂肪細(xì)胞接種于含有10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%并接觸抑制2 d退出對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期后，更換為終濃度為0.5 mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)、5 μg/ml胰島素(INS)和1 μmol/L地塞米松(DEX)的細(xì)胞分化誘導(dǎo)液誘導(dǎo)2 d后，再更換含有55 μg/ml INS的維持培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2 d，隔2 d更換含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液。分化 8 d 后使用油紅O染色鑒定誘導(dǎo)效率。

1.3.8細(xì)胞的轉(zhuǎn)染 誘導(dǎo)成功的細(xì)胞待細(xì)胞密度達(dá)70%～80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。用Opti-MEM稀釋模擬物、抑制劑以及陰性對(duì)照組，并分別與轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體Lipofectmine 2000按2 ∶1混合均勻，室溫放置20 min，使其形成穩(wěn)定的復(fù)合物。再將復(fù)合物加入6孔板中，混勻，將6孔板置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后收取細(xì)胞，空白處理作陰性對(duì)照。實(shí)驗(yàn)分為3組：上調(diào)組、下調(diào)組和NC組。脂肪細(xì)胞因子脂聯(lián)素(adiponectin，APN，ADIPOQ)、Krüppel樣因子4(Krüppel-like factors, KLF4)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、單核細(xì)胞趨化因子1 (monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)、CCAAT /增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α(C/EBPα)和過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(PPARγ)總RNA提取后使用核酸定量分析儀分析RNA純度。合格的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用Step One熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)進(jìn)行PCR反應(yīng)。

1.3.9RNA提取及實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè) 提取總RNA、反轉(zhuǎn)錄按照TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit細(xì)胞及組織RNA提取試劑盒及PrimeScriptTMRT reagent Kit with Gdna Eraser試劑盒說明書進(jìn)行操作。Real-time PCR按照TB GreenTMPremic Ex TaqTMⅡ說明書操作。以U6為內(nèi)參基因，用2-ΔΔCt的方法表示miR-455b-3p相對(duì)于內(nèi)參基因的定量。引物序列見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)相關(guān)引物序列

2 結(jié)果

2.1 患者的基本信息34例患者的基本臨床信息見表2。其中，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組患者低密度脂蛋白和超敏C反應(yīng)蛋白升高，高密度脂蛋白和APN降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 患者的基本信息

2.2 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組配對(duì)比較圖1為使用散點(diǎn)圖顯示兩組之間倍數(shù)變化和顯著性之間的關(guān)系。Y軸是-log10(P值)(較高的值表示較大的顯著性)，并且X軸是倍數(shù)變化，即log2(miRNAs的表達(dá)量)。確定為顯著的探針在polt上標(biāo)記(FDRt檢驗(yàn)<0.05)。圖中的紅點(diǎn)表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的miRNA。

圖1 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組配對(duì)比較的散點(diǎn)圖

2.3 miRNA芯片篩選出的DE-miRNAs熱圖結(jié)果圖2為CAD(n=4)與對(duì)照(n=3)中差異表達(dá)的miRNA的分層聚類(差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05和差異倍數(shù)>2倍)。Columns顯示EAT樣品的聚類，行顯示基因的聚類。每個(gè)樣品中每種miRNA的表達(dá)強(qiáng)度從紅色變?yōu)榫G色，這分別表示相對(duì)高或低的表達(dá)。在圖的側(cè)面描繪了代表上調(diào)至下調(diào)的不同模式的表達(dá)簇。

2.4 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組EAT及血清中miR-455b-3p表達(dá)水平qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，miR-455b-3p在實(shí)驗(yàn)組EAT組織和血清中表達(dá)均上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖3。

2.5 miR-455b-3p與APN和FABP4 3′非翻譯區(qū)(3′-UTR)互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)選取PicTar(http://pictar.org/)、miRGen(http://www.diana.pcbi.upenn.edu/miRGen.html)、TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_50//)、miRWalk(http://www.microrna.org/microrna/)和miRDB(http：// mirdb.org / miRDB /)四個(gè)預(yù)測(cè)網(wǎng)站進(jìn)行。為了減少軟件預(yù)測(cè)的假陽(yáng)性，取至少同時(shí)滿足2個(gè)預(yù)測(cè)軟件的基因才能作為靶基因。圖4為預(yù)測(cè)出的結(jié)合位點(diǎn)。

2.6 miR-455b-3p表達(dá)譜3T3-L1前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)8 d后使用油紅O染色鑒定誘導(dǎo)效率(圖5)。3T3-L1前脂肪細(xì)胞經(jīng)過雞尾酒法誘導(dǎo)后分別于誘導(dǎo)0、2、4、6、8 d檢測(cè)miR-455b-3p的表達(dá)(圖6A)。

圖2 差異miRNA分層聚類熱圖

圖3 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組EAT和血清中miR-455b-3p表達(dá)水平A：EAT中miR-455b-3p表達(dá)水平；B：血清中miR-455b-3p表達(dá)水平；1：實(shí)驗(yàn)組； 2：對(duì)照組；與對(duì)照組比較：*P<0.05,**P<0.01

圖4 miR-455b-3p與APN 3′-UTR結(jié)合位點(diǎn)

圖5 誘導(dǎo)8 d后油紅O染色 ×200A： 3T3-L1前脂肪細(xì)胞；B：油紅O染色結(jié)果

2.7 miR-455b-3p對(duì)APN及脂肪細(xì)胞因子表達(dá)影響分別在脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化成熟0、2、4、6、8 d時(shí)檢測(cè)miR-455b-3p在3T3-L1細(xì)胞中的表達(dá)，結(jié)果顯示miR-455b-3p呈先增多后減少并在8 d時(shí)達(dá)到最高的趨勢(shì)(圖6A)；miR-455b-3p轉(zhuǎn)染的3T3-L1細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后2 d通過qRT-PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示，miR-455b-3p表達(dá)為轉(zhuǎn)染前約15倍(圖6B)。對(duì)已誘導(dǎo)成熟的3T3-L1脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-455b-3p模擬物，與NC組比較，上調(diào)組3T3-L1脂肪細(xì)胞中APN、KLF4 mRNA表達(dá)減少，IL-6、MCP-1 mRNA表達(dá)增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖7A)；下調(diào)組3T3-L1脂肪細(xì)胞中APN、KLF4 mRNA表達(dá)水平升高，IL-6、MCP-1 mRNA表達(dá)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖7B)。

圖6 miR-455b-3p表達(dá)譜及轉(zhuǎn)染效率

A：miR-455b-3p在脂肪細(xì)胞分化過程中表達(dá)譜；B：miR-455b-3p轉(zhuǎn)染效率；1：NC組；2：上調(diào)組；3：下調(diào)組

2.8 miR-455b-3p促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化成熟如油紅O染色(圖8)所示，與NC組比較，上調(diào)組分化第8天時(shí)在脂滴積累較對(duì)照組增多，脂肪形成標(biāo)記基因PPARγ、C/EBPα的mRNA表達(dá)水平升高(圖9)。

3 討論

21世紀(jì)以來，冠心病是歐洲、美國(guó)以及亞洲國(guó)家導(dǎo)致死亡的最主要原因，占世界死亡人數(shù)的近三分之一。CAD的發(fā)生發(fā)展與脂代謝紊亂密切相關(guān)。EAT是一種位于心肌和心包臟層之間獨(dú)特的內(nèi)臟脂肪組織，EAT和心肌具有相同的微循環(huán)，這表明這兩種結(jié)構(gòu)之間有緊密的相互作用[4]。研究[5]表明EAT厚度是CAD獨(dú)立危險(xiǎn)因素，其厚度和代謝活性與CAD的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)性，在CAD患者中，增厚的EAT可能通過分泌促炎性細(xì)胞因子和其他機(jī)制促進(jìn)斑塊的發(fā)展。

圖7 miR-455b-3p對(duì)脂肪細(xì)胞因子表達(dá)影響

A：上調(diào)組脂肪細(xì)胞因子的表達(dá)量；B：下調(diào)組脂肪細(xì)胞因子的表達(dá)量； 1：APN；2：KLF4；3：IL-6；4：MCP-1；與NC組比較：*P<0.05

圖8 雞尾酒法誘導(dǎo)3T3-L1前脂肪細(xì)胞8 d后油紅O染色鑒定 ×100A：3T3-L1前脂肪細(xì)胞；B：上調(diào)組油紅O染色結(jié)果

APN是一種脂肪細(xì)胞因子，對(duì)不同類型細(xì)胞具有提高胰島素敏感性、抗脂毒性、抗凋亡和抗炎作用，被認(rèn)為是具有保護(hù)作用的生物活性蛋白質(zhì)[6]。APN通過直接影響血管成分細(xì)胞(包括巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞)的行為來預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展。本研究顯示，CAD患者EAT中高表達(dá)的miR-455b-3p靶向調(diào)控APN表達(dá)。因此以miR-455b-3p為切入點(diǎn)，觀察其對(duì)APN的調(diào)控、對(duì)脂肪細(xì)胞因子表達(dá)以及對(duì)脂肪細(xì)胞分化的影響。

圖9 miR-455b-3p對(duì)脂肪標(biāo)志基因影響

A：上調(diào)組脂肪分化標(biāo)志物的表達(dá)量；B：下調(diào)組脂肪分化標(biāo)志物的表達(dá)量；1：PPARγ；2：C/EBPα；3：FABP4；與NC組比較：*P<0.05

miRNAs是一種具有調(diào)節(jié)功能的RNA，通過與對(duì)應(yīng)的靶信使RNA(mRNA)特異性結(jié)合來直接降解靶mRNA，從而抑制靶mRNA的翻譯，進(jìn)行基因的轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控[7]。miRNAs在脂肪組織中表達(dá)有差異，因此被認(rèn)為是代謝紊亂、CAD、2型糖尿病的診斷和治療潛在生物學(xué)標(biāo)志物[8]。近年來，人們對(duì)miRNA在脂肪細(xì)胞發(fā)育和肥胖的研究越來越深入[9]。研究[10]顯示miR-183通過靶向Smad4級(jí)聯(lián)調(diào)節(jié)PPARγ、C/EBPα、SREBP-1c和FAS，從而促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化。最近研究[11]表明，將miR-17-5p抑制劑尾靜脈注入動(dòng)脈粥樣硬化小鼠體內(nèi)后，動(dòng)脈血管組織中的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激水平有所降低。本研究顯示，CAD患者的EAT和血清中miR-455b-3p高表達(dá)，高表達(dá)的miR-455b-3p可能通過調(diào)控APN和FABP4，從而引起脂代謝紊亂和炎癥，并且促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化成熟。

肥胖既是心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，也與其他幾種危險(xiǎn)因素密切相關(guān)。脂肪細(xì)胞分化與人體肥胖的發(fā)生密切相關(guān)。脂肪分化過程由幾種轉(zhuǎn)錄因子組成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行高度程序化調(diào)控，包括CCAAT /增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(C / EBP)基因家族和過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(PPARγ)[12], 在這些因子中，最主要的是PPARγ和C/EBPα。

動(dòng)脈粥樣硬化是動(dòng)脈血流中內(nèi)皮層紊亂、單核細(xì)胞遷移至血管壁并分化為巨噬細(xì)胞及泡沫細(xì)胞的炎性反應(yīng)[13]。KLF4是一類具有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，KLF4能夠激活I(lǐng)L-10基因的表達(dá)，起到抗炎作用[14]。IL-6主要通過其介導(dǎo)的信號(hào)通路促進(jìn)炎癥反應(yīng)，是一種目前已知的炎癥因子[15]。MCP-1也稱為趨化因子(CC基序)配體2(CCL2)，參與炎癥、傷口愈合、纖維化和血管形成過程。

綜上，在冠心病心外膜脂肪組織中，脂代謝紊亂可能間接上調(diào)miR-455b-3p表達(dá)，而miR-455b-3p靶向調(diào)控APN表達(dá)，從而影響KLF4、IL-6和MCP-1等脂肪細(xì)胞因子分泌，導(dǎo)致其表達(dá)紊亂。同時(shí)miR-455b-3p能夠促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化成熟，促進(jìn)EAT在心外膜沉積及體積增多，從而引起CAD的發(fā)生發(fā)展，但其具體機(jī)制尚待進(jìn)一步探究。