巴戟天醇提取物對卵巢切除大鼠在高脂飲食狀態下骨質量的影響

高曦 陳翔 黃朱宋 藍錦福 關勇 林煜

廈門大學附屬福州第二醫院骨科，福建 福州 350007

骨質疏松癥(osteoporosis, OP)是以骨量減少、骨質量受損及骨強度降低，致使骨的脆性增加并易于發生骨折的一種全身性骨骼疾病。絕經后骨質疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)作為原發性骨質疏松癥中的I型，在OP總發病率中占有很高的比例。PMOP患者隨著臨床癥狀加重，骨折風險上升，生活質量下降，尤其當下肢長干骨發生骨折后若不積極治療將加重呼吸系統癥狀，甚至產生生命危險。肥胖是由于熱量攝入多于熱量消耗致使脂肪合成增加或者機體代謝的改變導致體內脂肪積聚過多的一種慢性代謝性疾病。現有研究已經發現肥胖與PMOP間存在密切的聯系[1-4]。肥胖患者在不同程度上存在BMD的降低，POMP患者呈現出脂肪堆積現象。目前肥胖的傳統治療周期長，容易反彈。PMOP的治療方案以西藥為主，不同藥物療效存在差異性，部分藥物療效不盡如人意。另一方面，中醫藥在肥胖及PMOP的治療上前景大，有廣泛的研究空間，可以補充現有針對肥胖和PMOP的治療方案。現階段對于中藥巴戟天的研究發現其對改善患者BMD效果良好，已在臨床上得到運用[5]，但針對巴戟天單體的研究較為缺乏。介于現階段PMOP及肥胖患者發病率高，巴戟天療效明確，因此本研究通過動物實驗，探討巴戟天醇提取物對卵巢切除大鼠在高脂飲食狀態下骨質量的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物：3月齡健康SPF級雌性SD大鼠160只，體重200±20 g，由上海克萊實驗動物有限公司提供，實驗動物許可證號：SCXK(滬)2016-0002，合格證編號：2007000562039。在福建省中醫藥研究院比較醫學中心喂養，醫學實驗動物環境設施為SPF級，合格證號: 醫動學第23-016號。

1.1.2實驗藥物：巴戟天醇提物：原藥材購自福州回春連鎖藥店，由安徽亳州市長生中藥飲片有限公司生產，參照文獻[6]方法提取藥物，醇提取物的濃度為2 g/mL。高脂飼料配方：1%膽固醇、15%豬油、84%基礎飼料。

1.2 方法

1.2.1造模與分組：將3月齡健康SPF級雌性SD大鼠160只，于動物房適應性飼養1周后，隨機分為2組：卵巢切除組120只、假手術組40只。卵巢切除組行雙側卵巢切除術，術后肌注青霉素(8萬U/只)，連續注射3 d。假手術組除不切除雙側卵巢，其余操作同卵巢切除組。術后卵巢切除組再隨機分為3組：正常飲食模型組、高脂飲食模型組、高脂飲食巴戟天醇提取物組各40只。假手術組、正常飲食模型組用普通飼料喂養，高脂飲食模型組、高脂飲食巴戟天組用高脂飼料喂養。

1.2.2灌胃：各組大鼠統一于術后第3天灌胃，每天1次。高脂飲食巴戟天醇提取物組：巴戟天醇提物組20 g/(kg.d)，醇提取物用生理鹽水2 mL溶解后灌胃，余下3組每天灌服生理鹽水2 mL/只。

1.2.3相關指標檢測：各組分別于干預前、干預4、8、12周時隨機取10只處死取材。取材時以戊巴比妥鈉麻醉。分離右側脛骨，放置于-80 ℃冰箱凍存待測，分離出大鼠左側脛骨固定于4%多聚甲醛溶液中，用于制作骨組織的Masson染色切片。

(1) 骨密度檢測：應用雙能X線4 500 W骨密度儀(美國Hologic公司)測定大鼠右側脛骨BMD。

(2) 生物力學檢測：使用IG-A1 000 N萬能材料試驗機(日本島津公司)運用三點抗彎法測定右側脛骨的最大載荷。

(3) 骨組織形態學檢測：將分離出各組大鼠左脛骨近端作Masson染色。在顯微鏡下觀察脛骨近側干骺端及腰椎骨組織形態結構改變。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 各組大鼠體重影響的時序性變化

如表1 所示，隨機分組后，各組大鼠體重無顯著差異；第4周開始高脂飲食各組體重均大于正常飲食組，去勢各組大于假手術組，第12周各組差異最為顯著，高脂飲食模型組最高，高脂飲食巴戟天組次之，正常飲食模型組再次之，假手術組最低，各組比較差異有統計學意義(P<0.05)。

表1 不同時間各組大鼠體重檢測結果Table 1 Weight of rats in each group at different time (g,

注：與假手術組比較，aP<0.05；與正常飲食模型組比較，bP<0.05；與高脂飲食模型組比較，cP<0.05；與高脂飲食巴戟天組比較，dP<0.05。

2.2 巴戟天對大鼠骨密度的影響

結果顯示，與同期假手術組相比，各模型組骨密度明顯降低(P<0.05),與同期高脂飲食模型組相比，各組骨密度均有增加，高脂飲食巴戟天組最高，正常飲食模型組次之。各假手術組之間骨密度相差不大(表2)。

表2 不同時間各組大鼠骨密度檢測結果Table 2 BMD of rats in each group at different time (g/cm2,

注：與假手術組比較，aP<0.05；與正常飲食模型組比較，bP<0.05；與高脂飲食模型組比較，cP<0.05；與高脂飲食巴戟天組比較，dP<0.05。

2.3 巴戟天對大鼠骨組織生物力學的影響

應用三點彎曲法行右脛骨生物力學檢測，結果顯示，與同期假手術組相比，各模型組力學強度明顯降低(P<0.05),與同期高脂飲食模型組相比，各組力學強度均有增加，高脂飲食巴戟天組最高，正常飲食模型組次之(表3)。

表3 不同時間各組大鼠脛骨最大載荷力檢測結果Table 3 Maximum load of the tibia of rats in each group at different time (n,

注：與假手術組比較，aP<0.05；與正常飲食模型組比較，bP<0.05；與高脂飲食模型組比較，cP<0.05；與高脂飲食巴戟天組比較，dP<0.05。

2.4 巴戟天對大鼠骨組織形態學的影響

骨組織經Masson染色后骨小梁呈藍綠色，骨髓細胞呈紅色。干預前各組，4、8、12周假手術組大鼠脛骨上段的骨小梁排列規則緊密，分布均勻，交織呈網狀，連續無斷裂。隨著手術后時間的延長，模型組變化明顯，骨小梁數量逐漸減少，變得稀疏、斷裂、邊緣多顯粗糙。高脂飲食巴戟天組以及正常飲食模型組與同期高脂飲食模型組相比，骨小梁數量呈現不同程度地增多，間距變小，斷裂現象少，形態結構完整性較好，但均不及假手術組。各藥物干預組骨小梁面積比隨著用藥時間延長，逐漸增加。圖1～13。

圖1 干預前Fig.1 Before the intervention

圖2 4周假手術組Fig.2 Sham operation group, 4 weeks

圖3 4周正常飲食模型組Fig.3 Normal model group, 4 weeks

圖4 4周高脂飲食模型組Fig.4 High-fat diet group, 4 weeks

圖5 4周高脂飲食巴戟天組Fig.5 Morinda officinalis group, 4 weeks

圖6 8周假手術組Fig.6 Sham operation group, 8 weeks

圖7 8周正常飲食模型組Fig.7 Normal model group, 8 weeks

圖8 周高脂飲食模型組Fig.8 High-fat diet group, 8 weeks

圖9 8周高脂飲食巴戟天組Fig.9 Morinda officinalis group, 8 weeks

圖10 12周假手術組Fig.10 Sham operation group, 12 weeks

圖11 12周正常飲食模型組Fig.11 Normal model group, 12 weeks

圖12 12周高脂飲食模型組Fig.12 High-fat diet group, 12 weeks

圖13 12周高脂飲食巴戟天組Fig.13 Morinda officinalis group, 12 weeks

3 討論

OP是以骨量減少、骨質量受損及骨強度降低，致使骨的脆性增加并易于發生骨折的一種全身性骨骼疾病[7]。而PMOP在OP的發病率中占有很高的比例。PMOP的最大危害是骨折，而骨的微結構遭到破壞是PMOP發生骨折直接原因[8]。現代醫學認為PMOP的發生與卵巢功能衰退、雌激素水平下降密切相關。另一方面，肥胖是當今世界成上升趨勢的慢性代謝性疾病。研究發現，體重上升可增加絕經后婦女的骨折風險[9-10]，而隨著絕經后體內雌激素水平的下降，機體瘦素水平降低，肥胖基因表達增加，繼而引發機體脂肪蓄積導致肥胖[11-12]。

中藥巴戟天是我國的四大南藥之一，根據中藥學論述其具有補腎陽、強筋骨、祛風濕的功效。現階段實驗室研究結果表明，巴戟天能夠抑制破骨細胞活性，促進成骨細胞增殖，提高BMD，改善大鼠因卵巢切除術后導致的骨的微觀結構的改變[13-14]。臨床研究也表明，巴戟天水煎劑能改善骨質疏松患者骨代謝指標。

臨床上BMD是診斷PMOP的黃金標準，通過BMD檢測可以反映骨組織中骨量的變化。結合形態學切片能更直觀的觀察骨組織中骨量的變化和骨微觀結構的改變。另一方面，骨折是PMOP的并發癥之一，而骨的生物力學檢測可以客觀的反映骨組織對抗外力的能力，更好地評價臨床療效。

通過本研究發現，卵巢切除術后，卵巢切除組相對假手術組，BMD、脛骨最大載荷均有不同程度降低(P<0.05)，同時4、8、12周假手術組大鼠脛骨上段的骨小梁排列規則緊密，分布均勻，交織呈網狀，連續無斷裂。卵巢切除組變化明顯，骨小梁數量逐漸減少，變得稀疏、斷裂、邊緣多顯粗糙。同期卵巢切除組大鼠體重較假手術組呈現不同程度的提高。說明卵巢切除術后，隨著雌激素水平的下降，機體開始出現脂肪的蓄積，同時大鼠的骨質量降低，骨的微觀結構遭到破壞。比較高脂飲食組和正常飲食組發現，隨著干預時間的延長，高脂飲食組大鼠體重較正常飲食組大鼠體重呈現上升趨勢，而同期的BMD及脛骨最大載荷則表現出下降趨勢。說明在一定程度上肥胖會加重卵巢切除大鼠骨質疏松的程度。而與高脂飲食巴戟天組相比，同期正常飲食模型組和高脂飲食模型組，各組BMD均呈現不同程度的下降；

各組的脛骨最大載荷也呈現不同程度下降(P<0.05)；高脂飲食巴戟天組與同期高脂飲食模型組相比，骨小梁數量呈現不同程度地增多，間距變小，斷裂現象少，形態結構完整性較好。說明巴戟天醇提取物能有效的改善因卵巢切除術后引起的骨質量的改變，改善骨的微觀結構。

綜上所述，高脂飲食能夠加重卵巢切除術后大鼠骨量的丟失和骨微觀結構的破壞，降低骨的最大載荷。而巴戟天醇提取物能夠抑制卵巢切除術后大鼠骨量的流失，在一定程度上維持骨的微觀結構，提高骨的最大載荷及骨密度。