四川省宜賓地區健康成人外周血淋巴細胞亞群參考區間的建立 *

劉 炳，郭 欣，鄭 凡，江燕紅，蔣淼璐

(宜賓市第二人民醫院a.檢驗科；b.普外科，四川宜賓 644000)

隨著流式細胞技術在臨床上的廣泛運用，淋巴細胞亞群分析能客觀反映機體當前的免疫功能，在艾滋病、白血病、腫瘤疾病、感染性疾病等疾病的輔助診斷、發病機制分析、療效觀察及預后判斷方面具有重要意義[1-4]。目前國內尚無統一的淋巴細胞亞群參考區間，也無針對四川省宜賓地區人群的相應參考區間。為更好地指導臨床診療，根據美國臨床和實驗室標準協會(clinical laboratory standards institute，CLSI)對檢驗項目參考區間設定的推薦程序[5]，擬對303例健康成人外周血進行淋巴細胞亞群分析，以建立本地區健康成人參考區間。

1 材料與方法

1．1 研究對象 選取2018年1～6月303例健康體檢人群，清晨空腹無菌靜脈血2 ml，EDTA抗凝，4 h內完成檢測。年齡18～86歲，其中男性172例，女性131例。根據我國衛生健康委員會分類方法將體檢人群分為18～44歲為青年組125例，45～59歲為中年組96例≥60歲為老年組82例。同時選取10例艾滋病晚期的病人，5例T淋巴瘤，5例急性B淋巴細胞白血病作為疾病對照組，以驗證本研究所得參考區間的正確性，入選對照組病例均符合相應疾病2018版臨床診療規范。入選研究人群必須符合如下條件：①無現病史、無吸煙史、無酗酒史，沒有影響檢測結果的生理指征；②實驗室檢查：血細胞計數正常，心、肝、腎功能檢測正常；③無血液系統疾病、無免疫系統疾病、無HIV，HBV，HCV，梅毒和其它急性傳染性疾??；④女性不在月經期、妊娠期、哺乳期。本研究經宜賓市第二人民醫院倫理委員會批準，所有研究對象均告知其實驗內容并簽署知情同意書。

1．2 試劑與儀器 試劑為杭州艾森生物科技有限公司產品：四色免洗淋巴細胞亞群分析試劑(CD3-FITC/CD8-PE/CD45-Percp/CD4-APC，CD3-FITC/CD16+56-PE/CD45-Percp/CD19-APC)，BECKMAN COULTER IMMUNO-TROL Cells質控血，ACEA NovoCyte QC Particles微球校準品等；儀器：ACEA NovoCyte流式細胞儀。

1．3 方法

1．3．1 儀器校正：取出ACEA NovoCyte QC Particles微球校準品平衡至室溫，渦旋混勻5s，在0.5 ml PBS液中加入1滴熒光微球，渦旋混勻，每次開機用ACEA NovoCyte QC Particles對流式細胞儀器進行光路及液路的校準，記錄前向散射光(FS)及各熒光信號的半峰變異系數(HPCV)值，追蹤一段時間內HPCV的變化，要求變異系數(CV)控制在3%以內，以確保儀器處于穩定狀態，保證實驗結果的準確可靠。每次檢測用BECKMAN COULTER IMMUNO-TROL Cells質控血進行一次室內質控，操作與標本檢測相同。

1．3．2 標本檢測：檢測過程根據試劑盒說明書，每份標本同時做2管，即CD3-FITC/CD8-PE/CD45-Percp/CD4-APC，CD3-FITC/CD16+56-PE/CD45-Percp/CD19-APC。在每一管中分別加入相應熒光抗體試劑20 μl及反向加入混勻的抗凝全血50 μl于各試管底部，旋渦混合后置室溫暗處孵育15 min，然后加入已稀釋的10倍溶血液450 μl，再置室溫暗處溶血15 min，渦旋混勻5 s后上機分析，利用NovoExpress軟件按順序測定各管的光散射及熒光信號并同時分析實驗數據。

1.4 質量保證 參加衛健委室間質評成績滿意，室內質控在控。

2 結果

2.1 不同性別健康成年人外周血淋巴細胞亞群檢測結果比較 見表1。各組數據經Kolmogorov-Smirnov檢驗，均符合正態分布，不同性別CD3+(個/μl)，CD3+CD4+(%)，CD3+CD4+(個/μl)，CD3+CD8+(%)，CD3+CD8+(個/μl)，CD4+/CD8+，CD3-CD19+(%)，CD3-CD19+(個/μl)之間差異均無統計學意義(均P>0.05)；但男性CD3+(%)低于女性，差異具有統計學意義(P<0.05)，男性CD3-CD16+CD56+(%)，CD3-CD16+CD56+(個/μl)均高于女性，差異具有統計學意義(P<0.05)。

表1 不同性別健康成人淋巴細胞亞群結果比較

2.2 不同年齡組健康成年人外周血淋巴細胞亞群檢測結果比較 見表2。各組數據經Kolmogorov-Smirnov檢驗，均符合正態分布，采用單因素方差分析，各年齡組除CD3+CD4+(個/μl)，CD3-CD19+(%)，CD3-CD19+(個/μl)，CD3-CD16+CD56+(個/μl)差異無統計學意義(P>0.05)，其余各項淋巴細胞亞群差異均具有統計學意義(P<0.05)，具有統計學意義的項目各年齡組間兩兩比較采用LSD檢驗。

表2 不同年齡組健康成人淋巴細胞亞群結果比較

注：a青年組與中年組相比，P<0.05；b青年組與老年組相比，P<0.05；c中年組與老年組相比，P<0.05；d青年組與中年組相比，P>0.05；e中年組與老年組相比，P>0.05。

2.4 臨床標本檢測結果 入選疾病病例中10例艾滋病晚期病例，CD3+CD4+(%)及CD3+CD4+(個/μl)計數均低于本研究所得參考區間，5例T淋巴瘤病例CD3+(%)及CD3+(個/μl)計數均高于本研究所得參考區間，5例急性B淋巴細胞白血病中CD3-CD19+(%)及CD3-CD19+(個/μl)計數均高于本研究所得參考區間，說明本研究結果對于臨床診療有效。

3 討論

淋巴細胞是人類免疫系統的組成部分，按其發生遷移、表面分子和功能的不同，可分為T淋巴細胞、B淋巴細胞和NK淋巴細胞，T淋巴細胞按功能又可分為輔助性T淋巴細胞、細胞毒性T淋巴細胞等，臨床上很多疾病如感染性疾病、免疫缺陷性疾病、腫瘤性疾病及藥物的使用均可導致淋巴細胞數量和功能的變化，比如評價艾滋病病程的重要監測指標為CD3+CD4+淋巴細胞計數[6-8]。為此確定淋巴細胞亞群的正常參考區間對臨床診療很有必要。

目前階段我們使用的參考區間多來源于試劑說明書、教科書、文獻報道等，此類參考區間的來源多局限于部分實驗室數據而不具普遍代表性。淋巴細胞亞群的參考區間受社會、環境等多因素的影響，不同地區、種族、年齡的人群淋巴細胞免疫分型存在差異[9-11]，此類參考區間無法滿足本地區臨床診療的需要，從表1、表2可以看出，部分淋巴細胞亞群項目參考區間與性別、年齡有相關性，這與梁君等[12-13]報道相似。本研究中部分淋巴細胞亞群項目的百分比在分組間差異有統計學意義，但其對應的絕對計數在分組間差異無統計學意義，這可能與本研究選用儀器的檢測原理有關，本研究淋巴細胞亞群絕對計數采用單平臺體積法計算原理，這有別于采用微球計數原理的流式細胞儀，進一步證實淋巴細胞亞群絕對計數的參考區間建立還應考慮儀器檢測原理等因素，尤其是有不同檢測系統的流式細胞實驗室。從表3中還發現隨著年齡的增長，淋巴細胞亞群的數目也會發生一定的變化，這與相關報道相似[14]，這可能與淋巴細胞的生理功能有關。同時將本研究所得外周血淋巴細胞參考區間與我院現使用參考區間比較，從中可以看出除男性CD3-CD16+CD56+(個/μl)與現使用的參考區間進行比較差異無統計學意義，其余各項目與現使用的參考區間進行比較，差異有統計學意義。利用本研究建立的參考區間與相關疾病進行結果驗證，20例病例結果均在參考區間之外。本研究所得參考區間因考慮性別、年齡等因素，其結果更符合臨床診療的實際情況。

本研究證實淋巴細胞亞群存在年齡、性別及檢測儀器型號等差異，這與WONG等[15]研究相似，因此各實驗室要根據具體情況制定符合的參考區間，建立本地區健康成年人外周血淋巴細胞亞群參考區間，并擴展其運用領域。本地區是我省艾滋病高流行區之一，有利于今后預防、診斷AIDS，為抗病毒治療以及療效評價提供更為有效、準確的科學依據。本研究不足之處是未將未成年人納入研究范圍，尚需要多中心大規模實驗室共同對健康人群參考區間做進一步調查研究。