Nrf2/Keap1/ARE信號通路和髓核細胞自噬的研究進展

常洪澤，劉曉東

(同濟大學附屬楊浦醫院骨科，上海 200090)

自噬是一種將受損、無用的蛋白質或其他細胞質成分通過溶酶體降解的分子代謝過程，已被定義為對維持細胞穩態至關重要的適應性途徑[1]。在自噬過程中，胞質底物被雙膜囊泡或自噬體攝取，隨后轉移至溶酶體進行降解，并在自噬溶酶體(自噬體和溶酶體的融合產物)中再循環[2]。研究表明，自噬涉及各種人類疾病，包括代謝疾病、神經退行性疾病、癌癥和傳染病等，自噬調節可作為多種疾病的潛在治療靶點[3]。核因子E2相關因子2(nuclear factor erythroid 2- related factor 2，Nrf2)是一個重要的保護性轉錄因子，通過調節與解毒，抗氧化防御和細胞保護等相關基因組的表達介導能量代謝，調控細胞周期和細胞自噬[4]。Nrf2相關信號通路與自噬之間存在復雜的調節機制，探討兩者之間的關系對疾病的治療具有重要意義。

髓核是一個無血管、無神經組織，髓核細胞數量減少被認為是椎間盤退變的重要特征。在椎間盤退變性疾病的發生、發展過程中，自噬對髓核細胞死亡有重要的調控作用[5]。因此，深入研究Nrf2相關信號通路對髓核細胞自噬的作用為對椎間盤退變性疾病的發生機制和治療提供新思路。現就細胞自噬在Nrf2相關信號通路以及髓核細胞中的研究進展予以綜述，為椎間盤退變的分子機制提供新視角。

1 自噬與Nrf2信號通路的關系

1.1自噬的發生機制 1859年法國生理學家Anselmier在一篇描述小鼠禁食影響的短篇文章中首次使用了術語“自噬”[6]；一個世紀后，比利時科學家de Duve在溶酶體國際會議上從機械的角度解釋了自噬[6]。此后，自噬引起了生物界的廣泛關注。在正常生理條件下或營養剝奪、生長因子消耗、氧化應激、缺氧等應激條件下都可能引起細胞自噬的發生[7]。自噬是一個協調良好的過程，包括起始、囊泡成核、膜延伸和關閉、成熟和降解4個步驟，這一連續過程受到大約30個自噬相關基因的調控。自噬起始階段涉及兩種蛋白激酶復合體：Unc- 51樣激酶1/2(Unc- 51- like kinases 1/2,ULK1/2)復合體和Ⅲ型磷脂酰肌醇- 3- 激酶(class Ⅲ phosphoinositide 3- kinase,PI3KC3)復合物，也稱Vps34復合物。ULK1/2復合體由ULK1/2、自噬相關基因13(autophagy related gene 13,Atg13)、200 kD的黏著斑激酶家族相互作用蛋白組成。Vps34復合物由Beclin 1、Atg14、液泡蛋白分選15和Ⅲ型PI3K組成。在營養充足條件下，ULK復合物與雷帕霉素復合物1相偶聯，通過磷酸化雷帕霉素復合物1導致ULK1/2失活來抑制自噬[8- 9]。相反，在應激條件下，AMP激活的蛋白激酶通過直接磷酸化ULK1/2或通過結節性腦硬化復合物1/2途徑抑制雷帕霉素復合物1激活ULK1/2復合體[10]。被激活的ULK1/2磷酸化并激活Atg13和200 kD的黏著斑激酶家族相互作用蛋白。液泡蛋白分選34復合物組分AMBRA1和Beclin 1 也被ULK1磷酸化而激活[11]。這一系列事件使PI3KC3復合物募集和活化產生“隔離膜”，稱為吞噬泡。上述步驟一旦觸發后，吞噬泡進入囊泡成核階段。PI3KC3復合物激活后能使磷脂酰肌醇的第三位羥基磷酸化生成磷脂酰肌醇- 3- 磷酸。然后磷脂酰肌醇- 3- 磷酸結合位于“隔離膜”表面的雙FYVE結構域蛋白1和磷酸肌醇相互作用蛋白家族蛋白，導致其成核[12]。吞噬泡的延伸和關閉涉及兩類泛素化修飾反應。第一個反應，Atg7(E1樣酶)和Atg10(E2樣酶)催化Atg12和Atg5(底物)之間偶聯。然后，Atg12/Atg5連接物通過非共價與Atg16L相互作用形成四聚體結構[13]。第二個反應，微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule- associated protein1 light chain 3,LC3)首先被Atg4水解成LC3- Ⅰ(胞質形式)，然后Atg12/Atg5/Atg16L復合物介導LC3- Ⅰ與磷脂酰乙醇胺結合生成LC3- Ⅱ(脂化形式)。LC3- Ⅱ促進吞噬泡伸長并隨后封閉其內層和外層，導致自噬體的形成[14]。在延伸過程中，銜接蛋白p62/SQSTM1、自噬相關受體Brca 1鄰位基因和核點蛋白52 通過與LC3- Ⅱ直接作用介導泛素化細胞質內容物(包括細胞器和聚集蛋白質)的選擇性隔離[15- 16]。隨后，新生的自噬體沿著微管軌道向周圍溶酶體豐富的微管組織中心轉移[17]。在轉移過程中，自噬體首先與內體囊泡或多泡體(也稱amphisomes)融合形成自體吞噬泡，然后與溶酶體融合形成自噬溶酶體，這一過程稱為自噬體成熟。自噬體在與溶酶體緊密接近的過程中，涉及栓系因子的協調功能，其中最重要的是可溶性N- 乙基馬來酰亞胺敏感因子附著蛋白受體和同型融合及蛋白分選復合物[18- 19]。最后，自噬體內的內容物被溶酶體酸性水解酶消化，產生堿性代謝物，用以實現細胞本身的代謝需要和某些細胞器的更新。質子泵液泡型H+ATPase的激活是溶酶體消化的關鍵獨立步驟[20]。

1.2Nrf2/Keap1/ARE信號通路的概述 核轉錄因子Nrf2屬于CNC堿性亮氨酸拉鏈家族，包含7個功能域，Neh(Nrf2- ECH同源性)1至Neh7[21- 22]。N端結構域(Neh2)負責Nrf2和Keap1之間的相互作用以及Nrf2的穩定性和泛素化，而Neh5結構域調節Nrf2的細胞定位[22- 23]。具有基本亮氨酸拉鏈基序的Neh1結構域與下游的抗氧化反應元件(antioxidant responsive element,ARE)序列結合。此外，該結構域還可以與E2泛素結合酶相互作用，調節Nrf2的穩定性[24]。Neh3結構域的C端與轉錄共激活因子CHD6相互作用，負責染色質重塑后ARE依賴性基因的反式激活[22- 23,25]。Keap1是Nrf2的主要細胞內調節物，包含5個結構域。其中BTB、IVR和DGR結構域對抑制Nrf2活性非常重要。Keap1的KELCH結構域與胞質中Nrf2- Neh2結構域的DLG和ETGE基序結合,結合過程中ETGE作為高親和力的鉸鏈，DLG充當門閂(鉸鏈- 門閂假說)。在生理條件下，Nrf2與負調節子Keap1結合位于胞質中，通過含有E3的Cul3泛素連接酶，促進Nrf2泛素化繼而被蛋白酶體降解，維持較低的水平[26]。在氧化應激或Nrf2激活劑條件下，Keap1的半胱氨酸殘基發生巰基化修飾，導致Nrf2與Keap1解離。然后Nrf2易位到細胞核中與小Maf蛋白結合成異二聚體，并激活ARE，啟動下游一系列基因的表達[27]。Keap1介導的泛素化及降解是調Nrf2活性的主要途徑,但有研究表明，糖原合成酶激酶3β通過激活E3泛素連接酶復合物β- 轉導重復相容蛋白- S期激酶相關蛋白1- 滯蛋白1- 環盒子蛋白1指導Nrf2泛素化和蛋白酶體降解。糖原合成酶激酶3β能夠使位于Nrf2的Neh6結構域中的絲氨酸殘基磷酸化，然后其被β- 轉導重復相容蛋白識別，并通過與Cul1蛋白的結合導致Nrf2泛素化和以不依賴氧化還原的方式降解[28]。也有研究揭示了p62依賴的Nrf2激活的非經典途徑，p62將Keap1捕獲至自噬體降解，使Nrf2處于穩定狀態以及Nrf2依賴性基因的反式激活[29]。

1.3自噬與Nrf2/Keap1/ARE信號通路之間的作用機制 自噬與Nrf2之間存在著復雜的調控機制,目前許多分子機制尚不清楚。其中，研究最為廣泛的是選擇性自噬受體p62在自噬和Nrf2/Keap1/ARE信號通路中的作用。自噬發生時，p62的UBA和LIR發生磷酸化，分別與泛素化蛋白和LC3/Atg8連接，同時通過PB1發生自我聚集，最終與溶酶體融合完成泛素化底物降解[30]。p62蛋白是連接自噬與Nrf2/Keap1/ARE信號通路的橋梁,其KIR結構域與Nrf2的ETGE或DLG結構域相似，當自噬受到抑制時，p62降解受阻而大量積聚。積聚的p62蛋白與Nrf2競爭性結合Keap1，導致Nrf2從Keap1解離同時抑制Keap1- Cul3- E3泛素連接酶復合體使Nrf2發生泛素化降解而激活Nrf2[31- 32]。此外，在氧化應激條件下，Nrf2激活轉移入核后可以與p62基因啟動子上的ARE結合，使p62高表達[33]。自噬缺陷導致p62積累，p62與Nrf2競爭Keap1,使Nrf2激活,而激活的Nrf2又會促進p62表達,因此形成了一個抗氧化反應的正反饋環路[4]。p62介導的自噬對Nrf2/Keap1/ARE信號通路的作用研究較多，但近年來有實驗發現異去氧地膽草素可以通過Nrf2- p62正反饋環路激活保護性自噬維持細胞存活，Nrf2信號通路也可以對自噬進行調節[34]。有研究證明，自噬和Nrf2/Keap1/ARE通路之間存在共同調節途徑，PI3K是自噬起始涉及的重要蛋白激酶，Cong等[35]研究表明抑制胞外信號調節激酶和PI3K不僅可以減少Nrf2蛋白的核轉移，還可降低Nrf2蛋白的表達。聯合抑制胞外信號調節激酶和PI3K也可降低Nrf2靶基因mRNA的表達水平。AMP活化的蛋白激酶是一種高度保守的傳感器,其酶活力能夠被AMP上調。實驗已經證明AMP活化的蛋白激酶通過哺乳動物雷帕霉素靶蛋白和ULK1信號通路調控自噬，并且AMP活化的蛋白激酶誘導激活的Nrf2/SKN- 1傳導途徑可以改善氧化應激對細胞的損害[36]。

2 自噬在髓核細胞中的作用

下腰痛是一種非常常見的癥狀。它發生在高收入、中等收入和低收入國家以及從兒童到老年人口的所有年齡組[37]。2015年，活動限制性腰痛的全球患病率為7.3%，意味著全世界有5.4億人受到影響,腰痛已經成為全球殘疾的首要原因[38]。目前下腰痛的病因尚未明確,但椎間盤突出和椎間盤退變是導致下腰痛的兩種最常見原因[39]。髓核細胞通過產生Ⅱ型膠原蛋白、蛋白多糖和其他化合物在維持細胞外基質合成與降解的平衡中發揮重要作用，而在椎間盤退變過程中這種平衡被打破[40]。

2.1激活自噬可以抑制髓核細胞退變

2.1.1炎癥因子與髓核細胞自噬 自噬作為Ⅱ型程序性細胞死亡發生在組織和器官的發育過程中。在非退行性成年大鼠的髓核細胞中可以觀察到低水平的自噬，部分揭示了自噬在正常椎間盤髓核細胞中的生物學作用[41]。然而，在退行性大鼠髓核細胞中自噬水平顯著增加[42- 43]。因此，有足夠的證據證明退行性椎間盤髓核細胞中存在較高或較低水平的自噬，表明不同病理因素刺激下自噬在椎間盤髓核細胞中可能發揮不同的作用。細胞因子腫瘤壞死因子- α(tumor necrosis factor- α,TNF- α)和白細胞介素- 1β(interleukin- 1β,IL- 1β)加劇的炎癥過程被認為是椎間盤退變和下腰痛的關鍵事件,研究證明細胞因子可以提高基質金屬蛋白酶和聚集蛋白多糖酶的水平促進椎間盤細胞外基質的降解[44]。TNF- α和IL- 1β 能夠誘導自噬，相應的分子機制可能依賴于細胞類型。TNF- α和IL- 1β能誘導軟骨細胞，纖維環細胞自噬[45- 46]，但大鼠髓核細胞在加入TNF- α和IL- 1β 后自噬相關基因在mRNA水平和蛋白水平的表達沒有改變。然而，加入核因子κB和c- Jun氨基端激酶抑制劑能夠增強大鼠髓核細胞的自噬水平。因此，抑制核因子κB和c- Jun氨基端激酶信號通路能夠維持炎癥條件下髓核細胞的自噬[47]。白藜蘆醇在許多細胞類型中發揮抗TNF- α的作用，Wang等[48]研究結果顯示白藜蘆醇通過AMP激活的蛋白激酶/沉默信息調節因子2同源物1(silent information regulation 2 homolog- 1，Sirt1)信號通路激活自噬，減弱TNF- α誘導的人髓核細胞中基質金屬蛋白酶3的表達。這些發現表明細胞自噬有助于抑制炎癥條件下細胞外基質的降解而防止髓核細胞退變。

2.1.2沉默信息調節因子2同源物與髓核細胞自噬 Sirt1對哺乳動物細胞存活和壽命至關重要，在多種疾病中發揮重要作用，并且可作為治療不同疾病的靶點逐漸被人們重視。Jiang等[49]報道與正常髓核細胞相比，在退行性人髓核細胞中自噬體的數量顯著減少，但用Sirt1處理退變的髓核細胞后，通過促進自噬保護退化的人髓核細胞免于凋亡，表明自噬參與Sirt1對髓核細胞凋亡的保護作用。Chen等[50]在衰老的人類髓核細胞中發現Sirt6水平降低，過表達Sirt6可以在體內和體外激活髓核細胞自噬。加入自噬抑制劑3- 甲基腺嘌呤和氯喹后能夠部分逆轉調節變性相關蛋白表達的Sirt6的抗衰老和抗凋亡作用。結果表明Sirt6通過激活髓核細胞自噬減弱細胞衰老并減少細胞凋亡。因此，Sirt1、Sirt6可能是治療椎間盤退變的藥物靶點。

2.1.3內質網應激與髓核細胞自噬 內質網是真核細胞中重要的細胞器,是新合成跨膜蛋白和分泌蛋白折疊與成熟的加工廠。氧化應激、Ca2+紊亂以及未折疊或錯誤折疊的蛋白質可以誘導內質網應激反應或未折疊蛋白反應以恢復細胞內穩態[51]。Chang等[52]研究結果表明營養限制誘導髓核細胞凋亡的同時也會激活自噬的發生，早期自噬通過內質網應激的蛋白激酶受體樣內質網激酶/磷酸化真核翻譯起始因子2α/轉錄激活因子4通路抑制葡萄糖剝奪誘導的髓核細胞退變。內質網應激介導的髓核細胞自噬可能是防治椎間盤退變的一條新途徑。

2.1.4缺氧誘導因子1與髓核細胞自噬 髓核細胞長期處于椎間盤的無血管和缺氧微環境中，通過顯著表達缺氧誘導因子1適應缺氧微環境并存活[53]。在各種細胞類型中，缺氧以缺氧誘導因子1A依賴性方式誘導自噬，然而Choi等[54]研究發現低氧顯著增加髓核細胞自噬水平，但ULK1在哺乳動物雷帕霉素靶蛋白和AMP活化的蛋白激酶對應的Ser757和Ser777的磷酸化在缺氧時不受影響。當哺乳動物雷帕霉素靶蛋白活性被雷帕霉素或Torin1 抑制時，LC3- Ⅱ水平沒有改變。特異性敲除缺氧誘導因子1A小鼠的髓核細胞中LC3陽性自噬體的數量沒有變化。該研究首次表明髓核細胞以不依賴哺乳動物雷帕霉素靶蛋白和缺氧誘導因子1A信號轉導的非經典方式調控自噬，為髓核細胞自噬的研究提供了新的見解。

此外，也有研究發現瘦素可以通過胞外信號調節激酶- 哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路促進自噬抑制人退行性髓核細胞的凋亡[55]。葡萄糖胺通過哺乳動物雷帕霉素靶蛋白依賴性途徑誘導髓核細胞自噬可以抑制蛋白聚糖的降解并阻止由IL- 1β誘導的髓核細胞凋亡[56]。

2.2激活自噬可以促進髓核細胞退變 細胞自噬是不同于凋亡的另一種程序性細胞死亡，自噬既能發揮保護作用，也能促進細胞死亡。壓力應激是基質周轉中涉及的生理刺激，過量負荷可能是發生椎間盤退變的重要危險因素[57]。有研究表明，壓力誘導的自噬與細胞內活性氧類的產生密切相關，持續的壓力刺激產生大量的自由基，過度的自噬導致髓核細胞死亡[58]。糖尿病是影響許多結締組織的多器官疾病，包括骨和軟骨。高糖可加速髓核細胞的自噬。Jiang等[42]研究發現鏈脲佐菌素誘導的糖尿病可以通過加速髓核細胞的凋亡和衰老引起椎間盤退變，蛋白質印跡、免疫組織化學和透射電子顯微鏡顯示糖尿病大鼠髓核細胞中的自噬水平顯著高于對照組大鼠，表明自噬可能是糖尿病大鼠髓核細胞變化的反應機制，自噬可能加重椎間盤退變。Jiang等[59]研究發現髓核細胞經不同濃度高糖處理72 h后，自噬率增加。與對照組相比，過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator- activated receptor γ,PPARγ)、Beclin 1和LC3- Ⅱ的水平顯著增加且p62顯著降低。然后，分別用高糖加PPARγ激動劑或PPARγ拮抗劑處理髓核細胞。當使用PPARγ激動劑時，自噬率、Beclin 1和LC3- Ⅱ水平增加，但p62降低。相反，添加PPARγ拮抗劑時，自噬率和Beclin 1和LC3- Ⅱ水平降低，而p62升高。結果表明高糖誘導的髓核細胞自噬是通過PPARγ依賴的途徑實現的。這些研究表明,自噬可能加重高糖狀態下的椎間盤退變,因此一定程度上抑制髓核細胞自噬可能改善糖尿病患者的椎間盤退變。

3 小 結

自噬和Nrf2/Keap1/ARE信號通路都是細胞重要的防御機制，參與人類多種疾病的發生、發展，兩者之間存在復雜的交叉關系，以自噬和Nrf2/Keap1/ARE信號通路為靶點可以為許多疾病的防治提供新思路。自噬在髓核細胞中是一把“雙刃劍”，具體作用仍不清楚。因此，探討自噬在髓核細胞中的作用對椎間盤退變性疾病的發生機制和治療具有重要意義。Nrf2/Keap1/ARE信號通路在髓核細胞自噬中的作用研究較少，探索兩者之間的關系，有助于豐富人們對椎間盤退變發病機制的認識。隨著未來對髓核細胞自噬研究的不斷深入，調節髓核細胞自噬可能成為延緩或逆轉椎間盤退變過程的有效方法。