結直腸癌組織miR34a啟動子區甲基化狀態的臨床意義探討

袁航 屠世良

結直腸癌是常見、多發的惡性腫瘤之一。近年來，總發病率呈明顯遞增趨勢。一項流行病學調查報告顯示，結直腸癌發病率位居所有腫瘤的第5位，5年生存率較低[1]。因此，早期發現并給予個體化綜合治療具有重要意義[2]。microRNA（以下簡稱miRNA）是一類20～25個堿基的小分子非編碼RNA，廣泛存在于真核生物中。目前發現miRNA異常表達與腫瘤的發生、發展有著密切關系。關于miRNA的作用機制研究成為當前腫瘤發生機制研究的熱點。與其他基因一樣，腫瘤細胞中miRNA的表達受到包括DNA甲基化修飾在內的表觀修飾等多種機制的調控，且在多種腫瘤中miRNA基因甲基化狀態的改變與腫瘤臨床表型及預后有關。由于不同組織來源的腫瘤存在特征性的miRNA表達譜，其甲基化狀態也存在特異性[3]。目前關于結直腸癌中相關miRNA的CpG島甲基化狀態的研究仍較為少見。miR-34a是近年來發現的、具有抑癌基因樣功能的重要調控因子[4]。有研究對結直腸癌組織中表達有差異的miRNA基因進行生物信息學分析，結果發現miR-34a的啟動子區域或周圍有CpG島[5]。本研究對結直腸癌組織miR-34a啟動子區CpG島甲基化狀態的臨床意義作一探討，現將結果報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2011年7月至2012年7月在本院行根治性切除術的48例結直腸癌患者為研究對象，收集其結直腸癌組織及癌旁5cm以上的正常黏膜組織。其中男28 例，女 20 例；年齡 29～75[62.5（54.3，72.0）]歲。所有患者術前未行放化療；其病理診斷經2位病理科醫生獨立診斷明確，病理分期依據美國國立綜合癌癥網絡指南公布的TNM分期標準。本研究經醫院醫學倫理委員會審查通過，所有患者簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 結直腸癌組織及癌旁正常組織離體后盡快分塊，每塊150～200mg，液氮冷凍后置-80℃冰箱內備用。按照組織DNA抽提試劑盒說明書（北京天根生化公司）抽提結直腸組織基因組DNA，并測定濃度。

1.2.2 miR34-a啟動子區甲基化檢測 采用甲基化特異性PCR（MSP）法。通過在線Meth-Primer軟件（http://www.urogene.org/methprimer/）設計甲基化、非甲基化序列的引物（其信息見表1[5]），以亞硫酸氫鈉修飾后的DNA為模板進行PCR擴增：95℃預變性10min，94℃15s，共40個循環；55℃ 30s，72℃ 40s，再 72℃延伸 10min。非甲基化擴增體系的退火溫度提高至56℃，其他步驟相同。擴增產物為2.5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外光照射顯帶。RT-PCR：取1～2μl甲基化修飾型DNA進行PCR，擴增產物為2.5%瓊脂糖凝膠電泳，然后紫外光照射顯帶，確定與引物互補的DNA序列甲基化狀態。對PCR產物進行電泳，并根據電泳條帶情況進行判定：（1）甲基化特異性引物擴增出目的條帶，而非甲基化特異性引物未擴增出條帶，為甲基化；（2）非甲基化特異性引物擴增出目的條帶，而甲基化引物未擴增出條帶，為非甲基化；（2）對引物均能擴增出目的條帶的半甲基化，判斷為甲基化。

1.3 統計學處理 應用SPSS 18.0統計軟件。計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，采用log-rank法比較不同miR-34a啟動子區甲基化狀態的結直腸癌患者總生存率、無病生存率。結直腸癌預后危險因素的分析采用Cox比例風險回歸模型。P＜0.05為差異有統計學意義。

表1 miR-34a甲基化引物信息

2 結果

2.1 結直腸癌組織與癌旁正常組織中miR34-a啟動子區甲基化率比較 結直腸癌組織與癌旁正常組織中miR34-a啟動子區甲基化率分別為47.9%（23/48）、43.8%（21/48），差異無統計學意義（P＞0.05），檢測所得電泳圖見圖1。

圖1 結直腸癌組織與癌旁正常組織中miR34-a啟動子區甲基化狀態檢測電泳圖（M：甲基化；U：非甲基化）

2.2 結直腸癌組織miR34a啟動子區甲基化狀態與患者臨床特征的關系 結直腸癌組織miR34a啟動子區甲基化狀態與患者性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤最大直徑、遠處轉移等無關，差異均無統計學意義（均P＞0.05）；與淋巴結轉移、TNM分期等有關，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表 2。

2.3 結直腸癌組織miR34a啟動子區甲基化與患者預后的關系 本組患者隨訪時間15～100[52（42，79）]個月。23例結直腸癌組織甲基化患者1、3、5年生存率分別為100.0%、69.6%和 34.8%，25例非甲基化患者 1、3、5年生存率分別為100.00%、88.0%和72.0%。甲基化患者總生存率、無病生存率均低于非甲基化患者，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見圖 2-3。

2.4 結直腸癌預后危險因素分析 經單因素分析發現，腫瘤TNM分期、淋巴結轉移、遠處轉移、miR-34a啟動子區甲基化狀態與患者預后有關，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；性別、年齡、腫瘤最大直徑、病理組織學類型、分化程度、浸潤深度與預后均無關，差異均無統計學意義（均P＞0.05）。將上述單因素分析結果P＜0.05的因素納入Cox比例風險回歸模型分析，結果顯示遠處轉移是影響結直腸癌患者預后的獨立危險因素（P＜0.05），miR-34a啟動子區甲基化狀態不是影響結直腸癌患者預后的獨立危險因素（P＞0.05），見表3。

表2 結直腸癌組織miR34a啟動子區甲基化狀態與患者臨床特征的關系[例（%）]

表3 結直腸癌預后危險因素的Cox比例風險回歸模型分析

3 討論

miRNA主要通過促進靶mRNA的降解或抑制其翻譯過程來發揮調控作用，廣泛參與細胞增殖、凋亡、代謝及分化等過程。Monzo等[6]首次研究表明，結直腸癌及腺瘤性息肉組織中miR-143、miR-145表達明顯下調，并提出結直腸癌組織中存在特異性miRNA表達譜。隨后，結直腸癌組織特異性miRNA表達譜的測定以及其與患者臨床特征的關系成為研究熱點。miR-34a位于人染色體1p36.23，該位點多伴隨著多個基因的缺失或突變，與腫瘤的發生密切相關。在乳腺癌、肺癌組織中，miR-34a表達常下降或缺失；但關于其在結直腸癌組織中的表達情況，各研究結果尚不統一[4，7-9]。最近研究發現，miR-34a在其啟動子區具有p53蛋白結合位點，是p53直接下游靶基因，受p53激活轉錄，通過調控細胞周期相關蛋白（cyclinE2、cdk6等）的表達，使細胞周期阻滯于G1期，或通過抑制下游BCL-2靶基因來誘導細胞的凋亡[10]。Hiroshi等[9]在大腸癌細胞系HCT116和RKO中，觀察到miR-34a有抑制腫瘤細胞增殖的作用。

圖2 結直腸癌組織miR34a啟動子區甲基化與非甲基化患者總生存率的曲線

圖3 結直腸癌組織miR34a啟動子區甲基化與非甲基化患者無病生存率的曲線

甲基化是表觀遺傳修飾的主要方式之一。DNA甲基化在調控細胞正常發育、基因表達模式及基因組的穩定性中起著重要作用。DNA甲基化主要發生于CpG二核苷酸的胞嘧啶上。這些常在基因上游調控區的啟動子區高度聚集的CpG二核苷酸，稱為CpG島。在人類許多腫瘤中，都能發現不同程度的CpG島異常甲基化現象，表現為基因組整體甲基化下調，抑癌基因調控區域甲基化上調[11]。本研究檢測結果發現，部分患者結直腸癌組織miR-34a甲基化較高，但與癌旁正常組織比較差異無統計學意義，可能與本研究樣本量較小有關。進一步研究發現，結直腸癌組織中miR-34a基因CpG島甲基化狀態與腫瘤TNM分期、淋巴結轉移等有關，與患者預后無關。甲基化狀態與預后呈相關性，提示甲基化狀態的改變可能參與腫瘤增殖轉移過程，并影響預后。DNA甲基化修飾可能調控腫瘤細胞中相關miRNA的表達。Satio等[12]較早發現DNA甲基化可能會影響miRNA的表達，同時指出DNA甲基化和組蛋白修飾調控miR-127的表達，且甲基化與組蛋白修飾間存在一定的協同作用；miRNA不僅參與表觀遺傳的調控（DNA甲基化），還受到DNA甲基化等表觀遺傳影響。有研究報道miR-34a在宮頸癌、食管癌、肝癌等多種腫瘤組織中呈CpG島高甲基化狀態，且高甲基化所致的表達沉默或下調可能導致下游靶標增殖或凋亡相關癌蛋白高表達，從而促進腫瘤的發生、發展[5，13-16]。有研究在結直腸癌中也發現了一些相關miRNA存在甲基化調節機制[17]。某研究表明，結直腸癌中miR-34a低表達者，其啟動子區甲基化水平較高，兩者呈負相關[18]。本研究Cox比例風險回歸模型分析結果顯示，僅遠處轉移是預后的獨立預測因子，miR-34a啟動子區CpG島甲基化狀態尚不能作為獨立預測因子；這可能與樣本量較小有關，也可能是miR-34a與下游靶分子形成交叉網絡作用，而非獨立作用。以上猜想仍需后續機制研究進一步驗證。

綜上所述，miR-34a啟動子區甲基化狀態與結直腸癌患者淋巴結轉移、TNM分期及預后有關，可能參與腫瘤進展轉移過程的調控。