心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型的構(gòu)建及研究進(jìn)展

熊 偉，錢金橋

(昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉科，昆明 650032)

心血管疾病導(dǎo)致的死亡是居民疾病死亡的首要原因，占40%以上，高于惡性腫瘤及其他疾病，且處于持續(xù)上升狀態(tài)[1]。健康體檢的普及、先天性心臟病的篩查以及胸痛中心的建立為心血管疾病患者早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療爭(zhēng)取了時(shí)間，但冠狀動(dòng)脈溶栓術(shù)、成形術(shù)、支架置入術(shù)、搭橋術(shù)、導(dǎo)管封堵術(shù)以及和體外循環(huán)等心臟手術(shù)增加了圍手術(shù)期心肌缺血再灌注損傷的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。心肌缺血后恢復(fù)血液再灌注導(dǎo)致的心肌細(xì)胞損傷甚至壞死，稱為心肌缺血再灌注損傷，而心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷是其主要發(fā)病機(jī)制之一，此外，還包括氧化應(yīng)激、炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)釋放炎癥因子、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、線粒體損傷、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、內(nèi)皮細(xì)胞損傷、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、心肌能量代謝障礙等[2- 4]。體外構(gòu)建心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型，合理選擇細(xì)胞來(lái)源，模擬疾病病理狀態(tài)，并應(yīng)用于基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究，避免了臨床技術(shù)及醫(yī)學(xué)倫理的限制，有利于深入研究心肌缺血再灌注損傷的細(xì)胞分子機(jī)制。現(xiàn)對(duì)心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型的細(xì)胞來(lái)源、構(gòu)建方法及應(yīng)用進(jìn)展予以綜述，以期為臨床和基礎(chǔ)研究提供依據(jù)。

1 心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型

隨著科學(xué)技術(shù)和醫(yī)療水平的進(jìn)步，迫切地需要深入研究人體與疾病的關(guān)系和機(jī)制，多種細(xì)胞模型解決了動(dòng)物和臨床研究的局限性。雖然細(xì)胞模型不能完全反映疾病多器官的交互效應(yīng)和代謝改變，但具有實(shí)際操作過(guò)程可控性強(qiáng)、易于觀察、費(fèi)用低的優(yōu)勢(shì)，體外構(gòu)建心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型較動(dòng)物心肌缺血再灌注模型更能直觀反映細(xì)胞間的相互作用，排除體內(nèi)不可預(yù)知的干擾，且更易于操作、取材方便、檢測(cè)容易、符合倫理要求[5]。基于不同實(shí)驗(yàn)原理、實(shí)驗(yàn)要求和實(shí)驗(yàn)條件，不同方法的實(shí)驗(yàn)各有優(yōu)劣。根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求選擇合適的細(xì)胞種類和構(gòu)建方法模擬疾病結(jié)構(gòu)、功能及代謝變化形成理想的細(xì)胞模型，成為研究者關(guān)注的重點(diǎn)。

2 心肌細(xì)胞來(lái)源

動(dòng)物源性原代心肌細(xì)胞較常用，來(lái)源廣泛，主要來(lái)自胎鼠、乳鼠、新生大鼠和小鼠，此外，還有仔豬、成年兔、豚鼠、新西蘭乳兔、比格犬、新生樹(shù)鼩、獼猴等，以及特殊的轉(zhuǎn)基因、白血病、糖尿病小鼠。原代心肌細(xì)胞分離、純化和鑒定方法為：①分離：取心肌樣本剔除肌腱和結(jié)締組織，用彎眼科剪在3 g/L 2,3- 丁二酮單肟的含氧無(wú)Ca2+冰磷酸鹽緩沖液中將其剪成組織糜，經(jīng)2 mg/mL胰蛋白酶和1 mg/mL膠原酶在37 ℃水浴中連續(xù)鼓泡或均勻攪拌消化10 min，重復(fù)3次，當(dāng)細(xì)胞產(chǎn)量最大時(shí)，過(guò)濾、離心，用含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基重懸，隨后在37 ℃ 5%二氧化碳(CO2)飽和濕度條件下孵育[10]。②純化：純化方法主要包括差速貼壁法、酶抑法和密度離心法，最常用差速貼壁聯(lián)合酶抑法，經(jīng)差速貼壁分離2 h，去除未貼壁的非心肌細(xì)胞，加入含0.1 mmoL/L 5- 溴脫氧尿嘧啶核苷(抑制成纖維細(xì)胞增殖)的培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d，之后換正常培養(yǎng)基培養(yǎng)，每2～3天換液[11]。③鑒定：良好的心肌細(xì)胞具有較高的活性和純度，規(guī)律的動(dòng)作電位、良好的收縮狀態(tài)、穩(wěn)定的鈣瞬變和充足的能量供應(yīng)[12]。在細(xì)胞功能檢測(cè)方面，可使用倒置顯微鏡或共聚焦顯微鏡觀察形態(tài)結(jié)構(gòu)和節(jié)律性搏動(dòng)；MTT或臺(tái)盼藍(lán)染色測(cè)定存活率；流式細(xì)胞儀或α肌動(dòng)蛋白免疫組化檢測(cè)純度；鈣瞬變波形、動(dòng)作電位和線粒體膜電位等檢測(cè)電生理功能以及心肌損傷標(biāo)志物(肌酸激酶同工酶和心肌肌鈣蛋白T/I等)、氧化應(yīng)激標(biāo)志物(如超氧化物歧化酶、丙二醛、羥自由基及超氧陰離子自由基)和炎癥相關(guān)因子(如腫瘤壞死因子- α、白細(xì)胞介素- 6和核因子κB等)。

2.2心肌細(xì)胞株/系 因細(xì)胞株可穩(wěn)定傳代，遺傳信息不變，而細(xì)胞系可無(wú)限傳代，具有癌變細(xì)胞的特點(diǎn)，故可將細(xì)胞株/系廣泛運(yùn)用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究。大鼠胚胎心肌細(xì)胞H9C2和人肥厚型心肌病心肌細(xì)胞AC16是最常用的實(shí)驗(yàn)心肌細(xì)胞株，國(guó)家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源共享服務(wù)平臺(tái)提供大鼠胚胎心肌細(xì)胞H9C2(2- 1)和豚鼠心肌細(xì)胞GP- H1以及紅色熒光蛋白標(biāo)記的大鼠胚胎心肌細(xì)胞H9C2(2- 1)- tdT、H9C2(2- 1)- mCherry和H9C2(2- 1)- Luc2- tdT(螢光素酶)。美國(guó)種質(zhì)保藏中心提供人肥厚型心肌病心肌細(xì)胞AC16和人源誘導(dǎo)多功能心肌細(xì)胞系以及小鼠心房肌細(xì)胞HL- 1、大鼠胚胎心肌細(xì)胞H9C2(2- 1)和豚鼠心肌細(xì)胞GP- H1。此外，相關(guān)實(shí)驗(yàn)心肌細(xì)胞還有成人肥厚型心肌病心肌細(xì)胞a- 6210、大鼠心肌細(xì)胞RCM- R6200、小鼠心肌細(xì)胞MCM- M6200、豚鼠心肌細(xì)胞GP- H4和人肌原細(xì)胞Girardi等。

心肌細(xì)胞株/系復(fù)蘇、傳代和凍存方法為：①?gòu)?fù)蘇：快速融化，取細(xì)胞于37 ℃水浴中晃動(dòng)融解，1 000 轉(zhuǎn)/min速度離心3～5 min，棄上清，完全培養(yǎng)基(10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，必要時(shí)添加1.2 mmol/L巰代甘油、2 mmol/LL- 谷氨酰胺、營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑、100 μg/L重組人干細(xì)胞因子等)重懸，37 ℃ 5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)[13]。②傳代：細(xì)胞匯合至80%～90%時(shí)，棄培養(yǎng)基，加入胰酶消化，輕輕吹打細(xì)胞或拍擊瓶底，顯微鏡觀察細(xì)胞充分消化后，離心棄上清，重懸細(xì)胞，按1∶2接種[14]。③凍存：胰酶消化，離心沉淀細(xì)胞后，加入凍存液(基礎(chǔ)培養(yǎng)基+8%二甲基亞砜DMSO+20%胎牛血清)，分別于4 ℃冰箱(30 min)、-20 ℃冰箱(1～2 h)、-80 ℃冰箱或裝入含異丙醇的凍存盒(過(guò)夜)緩慢凍存，最后轉(zhuǎn)至液氮罐保存[15]。

3 缺氧/復(fù)氧模型構(gòu)建方法

3.1物理缺氧法 制備缺氧/復(fù)氧模型常用的物理缺氧法有混合氣體培養(yǎng)法和厭氧袋/罐法，前者采用一定比例的氮?dú)?N2)或氬(Ar)等惰性氣體與氧氣(O2)、CO2或空氣混合形成缺氧或復(fù)氧氣體狀態(tài)，在三氣培養(yǎng)箱、密閉培養(yǎng)盒或氣體罐中培養(yǎng)；后者參考厭氧菌培養(yǎng)方法，采用Anaero Gen厭氧袋(英國(guó)Oxiod公司)、Anaero Pack厭氧袋(日本三菱公司)和GasPak厭氧罐(美國(guó)GeneScience公司)密閉培養(yǎng)。Zhu等[16]將大鼠胚胎心肌細(xì)胞H9C2在95%N2和5%CO2缺氧條件下培養(yǎng)4 h，隨后在95%空氣和5%CO2復(fù)氧條件下培養(yǎng)24 h。Drevytska等[11]將Wistar新生大鼠心肌細(xì)胞在5%CO2和95%Ar缺氧條件下培養(yǎng)30 min，隨后在5%CO2、20%O2和75%Ar復(fù)氧條件下培養(yǎng)60 min。楊軼等[17]采用5%CO2安寧包和密閉培養(yǎng)盒通過(guò)物理吸收法使培養(yǎng)環(huán)境可氧氣濃度在1 h內(nèi)迅速降至0.1%，并使用無(wú)糖無(wú)血清培養(yǎng)基密閉培養(yǎng)缺氧后，在21%O2和5%CO2DMEM/F12培養(yǎng)基中進(jìn)行復(fù)氧。Yang等[18]采用一次性厭氧包、封閉劑和含鈀催化劑的鋼網(wǎng)自制快速缺氧系統(tǒng)，其效果優(yōu)于GasPak厭氧罐密閉培養(yǎng)。此外，液體石蠟封閉法采用液體石蠟隔絕無(wú)糖無(wú)血清培養(yǎng)基與外界的氣體交換，制造缺氧環(huán)境，而正常培養(yǎng)基開(kāi)放培養(yǎng)模擬復(fù)氧。曾文靜等[19]使用無(wú)糖無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞H9C2，并用2 mL高溫滅菌液體石蠟封閉缺氧4 h，隨后在37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中經(jīng)含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基復(fù)氧2 h即可成功造模。

3.2化學(xué)缺氧法 化學(xué)缺氧法主要包括氧耗法、酶抑法、超氧法和缺氧液法。氧耗法采用連二亞硫酸鈉(Na2S2O4)在短時(shí)間內(nèi)清除氧氣，且不影響培養(yǎng)細(xì)胞。余微等[20]對(duì)不同濃度Na2S2O4和不同時(shí)間缺糖缺氧條件下培養(yǎng)的SD乳鼠原代心肌細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，Na2S2O4>3 mmol/L時(shí)，心肌細(xì)胞活性降低、乳酸脫氫酶水平升高，且具有時(shí)間依賴性。Shi等[21]的研究發(fā)現(xiàn)，4 mmol/L Na2S2O4處理H9C2細(xì)胞6 h可降低超氧化物歧化酶和谷胱甘肽的含量，升高乳酸脫氫酶、肌酸激酶和丙二醛的含量。

酶抑法利用氯化鈷(CoCl2)競(jìng)爭(zhēng)性抑制鐵螯合酶或疊氮化鈉(NaN3)抑制細(xì)胞色素C氧化酶而中斷氧代謝呼吸鏈模擬缺氧損傷。超氧法利用過(guò)氧化氫(H2O2)釋放氧自由基產(chǎn)生氧化應(yīng)激模擬復(fù)氧損傷。Wang等[22]用0.05～0.2 mmol/L CoCl2低氧誘導(dǎo)C57BL/6小鼠心臟干細(xì)胞缺氧模型，促進(jìn)心臟干細(xì)胞增殖及遷移。Xu等[23]將心肌細(xì)胞H9C2置于30 mmol/L NaN3培養(yǎng)24 h構(gòu)建缺氧模型的研究發(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞凋亡增加、線粒體膜電位改變、細(xì)胞ATP含量減低，提示線粒體依賴性細(xì)胞凋亡可能與B淋巴細(xì)胞瘤- 2和Bax的上調(diào)以及線粒體分裂蛋白1的下調(diào)相關(guān)。Zhang等[24]使用0.5～1.5 mmol/L H2O2刺激心肌細(xì)胞H9C2模擬心肌缺血再灌注氧化應(yīng)激損傷的研究發(fā)現(xiàn)，miR- 129- 5p可能通過(guò)抑制磷脂酰肌醇- 3- 激酶/蛋白激酶B/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白途徑下調(diào)ATG14，從而減少心肌細(xì)胞自噬和凋亡。此外，還有缺氧液法，Prompunt等[25]將Wistar大鼠心室肌細(xì)胞經(jīng)缺氧液[由137 mmol/L氯化鈉(NaCl)溶液、3.8 mmol/L 氯化鉀(KCl)溶液、0.49 mmol/L 氯化鎂(MgCl2)溶液、0.9 mmol/L 氯化鈣(CaCl2)溶液、4.0 mmol/L HEPES緩沖液、20 mmol/L 2- 脫氧葡萄糖(糖酵解抑制劑)、20 mmol/L 乳酸鈉(模擬乳酸蓄積)組成，pH=6.5]和復(fù)氧液[由137 mmol/L NaCl、3.8 mmol/L KCl、0.49 mmol/L MgCl2、0.9mmol/L CaCl2、4.0 mmol/L HEPES緩沖液、20 mmol/L 2- 脫氧葡萄糖和1 mmol/L丙酮酸鈉組成，pH=7.4]模擬心肌缺氧/復(fù)氧損傷。

3.3聯(lián)合法 單純的物理缺氧法和化學(xué)缺氧法不能完全滿足缺氧/復(fù)氧損傷過(guò)程，改良的缺氧法結(jié)合了物理缺氧法和化學(xué)缺氧法的優(yōu)點(diǎn)，如氧耗法聯(lián)合缺氧液、氧耗法聯(lián)合超氧法、混合氣體法聯(lián)合缺氧液和三聯(lián)法等。Yuan等[26]采用氧耗法聯(lián)合超氧法模擬心肌細(xì)胞缺氧和復(fù)氧的雙向損傷過(guò)程，將心肌細(xì)胞置于4 mmol/L Na2S2O4處理6 h模擬負(fù)向的缺氧損傷，以及采用0.2 mmol/L H2O2處理心肌細(xì)胞24 h 以模擬正向的復(fù)氧損傷，但此方法不能體現(xiàn)細(xì)胞的持續(xù)缺氧微環(huán)境。Chen等[27]在此基礎(chǔ)上增加缺氧液[由137 mmol/L NaCl、0.49 mmol/L MgCl2、15.8 mmol/L KCl、0.9 mmol/L CaCl2、4.0 mmol/L HEPES緩沖液、10 mmol/L 2- 脫氧葡萄糖、20 mmol/L乳酸鈉和5 mol/L鹽酸組成，并將pH調(diào)至6.5(模擬酸中毒)]，更能反映缺氧環(huán)境持續(xù)作用于心肌細(xì)胞形成的損傷，上述方法能夠模擬細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)的環(huán)境缺氧/復(fù)氧損傷，但并未體現(xiàn)培養(yǎng)液外環(huán)境缺氧/復(fù)氧對(duì)細(xì)胞的影響。Cui等[28]將原代分離SD大鼠心肌細(xì)胞采用混合氣體法聯(lián)合缺氧液[95%N2和5%CO2充入8.0 g/L NaCl、0.2 g/L磷酸二氫鉀(KH2PO4)、2.9 g/L磷酸氫二鈉·十二水(Na2HPO4·12H2O)、0.2 g/L KCl、20 mmol/L乳酸鈉的D- Hanks緩沖液]在94%N2、5%CO2和1%O2三氣培養(yǎng)箱中缺氧2 h，隨后在95%空氣和5%CO2條件下，用含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基復(fù)氧4 h，此方法既避免了混合氣體無(wú)法滿足的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境改變，又解決了缺氧液的外部氧源問(wèn)題，更能反映細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境的缺氧/復(fù)氧改變。基于不同機(jī)制聯(lián)合使用多種方法構(gòu)建更接近缺氧/復(fù)氧損傷過(guò)程的理想模型是實(shí)驗(yàn)研究的最終目標(biāo)。Song等[29]采用混合氣體法、氧耗法和缺氧液三聯(lián)法，在5%CO2和95%N2條件下，利用氧耗缺氧液[由137 mmol/L NaCl、12 mmol/L KCl、0.49 mmol/L MgCl2、0.9 mmol/L二水氯化鈣(CaCl2·2H2O)、4 mmol/L 4- (2- 羥乙基)- 1- 哌嗪乙磺酸、10 mmol/L 2- 脫氧葡萄糖、0.75 mmol/L Na2S2O4和20 mmol/L乳酸鈉組成，pH=6.5]缺氧培養(yǎng)心肌細(xì)胞H9C2 2 h，然后5%CO2和95%O2下復(fù)氧培養(yǎng)4 h。此外，田友清等[30]使用Na2S2O4、N2和厭氧袋三種方法模擬心肌細(xì)胞H9C2缺氧/復(fù)氧均能復(fù)制損傷模型。三聯(lián)法增加了模型的準(zhǔn)確性，但存在操作復(fù)雜、價(jià)格昂貴、因素混雜等的缺點(diǎn)。

4 心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型的應(yīng)用

心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型主要應(yīng)用于缺血性心臟病發(fā)生發(fā)展和心血管藥物心肌保護(hù)機(jī)制研究，應(yīng)根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)選擇合適的細(xì)胞來(lái)源和構(gòu)建方法，不同心肌缺氧/復(fù)氧模型構(gòu)建方法具有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，見(jiàn)表1。Wang等[31]利用心肌細(xì)胞H9C2缺氧/復(fù)氧模型研究了樺木酸在Nrf2/HO- 1- p38/JNK信號(hào)通路的作用機(jī)制。Yu等[32]對(duì)心肌細(xì)胞H9C2缺氧/復(fù)氧模型的研究發(fā)現(xiàn)，己酸鈉固體分散黃連素可通過(guò)核因子κB和JNK信號(hào)通路提高其生物利用度和膜滲透性，從而發(fā)揮心肌保護(hù)作用，體現(xiàn)了心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧細(xì)胞模型在藥物信號(hào)通路及藥代途徑中的研究?jī)r(jià)值。Liu等[33]對(duì)SD新生大鼠原代心肌細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，miR- 130a可能通過(guò)抑制ATG14和Beclin1增加心肌細(xì)胞自噬和抑制凋亡。Heliste等[34]發(fā)現(xiàn)了幾種新的參與缺血性心臟靶蛋白表達(dá)及活性調(diào)節(jié)的酪氨酸受體激酶，并采用小鼠心房肌細(xì)胞株HL- 1構(gòu)建缺氧/復(fù)氧模型發(fā)現(xiàn)，受體酪氨酸激酶樣孤兒受體- 1是一種具有顯著調(diào)節(jié)活性的酪氨酸受體激酶，可作為預(yù)測(cè)缺血性心臟損傷治療的潛在靶點(diǎn)，提示心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型對(duì)研究缺血性心臟病關(guān)鍵基因、蛋白及其潛在治療靶點(diǎn)的應(yīng)用意義。

表1 不同心肌缺氧/復(fù)氧模型構(gòu)建方法及優(yōu)缺點(diǎn)比較

5 小 結(jié)

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ途哂薪?jīng)濟(jì)實(shí)惠、操作簡(jiǎn)便和檢測(cè)容易的優(yōu)勢(shì)，可廣泛應(yīng)用于藥物和疾病分子機(jī)制的研究。但由于細(xì)胞來(lái)源和構(gòu)建原理不同，每種方法都有其缺點(diǎn)，如物理法中的混合氣體培養(yǎng)法設(shè)備復(fù)雜、價(jià)格昂貴；厭氧袋/罐法不穩(wěn)定、難以監(jiān)測(cè)；液體石蠟封閉法操作復(fù)雜、影響觀察；化學(xué)法中的氧耗法難以檢測(cè)細(xì)胞活力；超氧法殺細(xì)胞作用強(qiáng)；酶抑法有毒；缺氧液法成分復(fù)雜、因素混雜；聯(lián)合法綜合了各種方法的優(yōu)點(diǎn)，但操作復(fù)雜、價(jià)格昂貴、起效緩慢。因此，難以用一種或多種方法模擬心肌缺血再灌注損傷的病理改變，但根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，選擇合適的細(xì)胞和方法構(gòu)建理想的模型，并結(jié)合動(dòng)物和臨床實(shí)驗(yàn)進(jìn)行綜合分析，能夠避免動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的體內(nèi)干擾和臨床研究的倫理規(guī)范問(wèn)題。