超薄切片不同制備方法和茶代鈾進行心肌淀粉樣變性的電子染色

趙然旭 魏英杰 李莉 王清峙 陸洋 徐紅宇 有一偉

[摘要] 目的 檢測烏龍茶提取物是否可作為電子染色劑取代醋酸雙氧鈾用于心肌淀粉樣變染色，并在染色過程當中使用不同的染色方法，改進制備方法，比較其安全性與高效性。 方法 收集中國醫學科學院阜外醫院2017年1～12月臨床懷疑淀粉樣變性的病例共計40例，其中心肌組織經病理學觀察和特殊染色呈陽性者10例。利用樹脂812常規包埋和改進后方法對心肌組織進行制備，再在復染鉛與不復染鉛這兩種情況下對超薄切片樣品進行兩種不同染色劑（3%醋酸雙氧鈾水溶液、0.5%烏龍茶提取物）和兩種不同染色方法（滴染法、切片盒染色法）的電子染色，然后在透射電子顯微鏡下觀察比較其不同之處。 結果 復染鉛的情況下，在透射電子顯微鏡下心肌中淀粉樣物質，利用2種電子染色劑和改進后的制備方法進行染色的結果均較理想，切片背景干凈，對比度高，所獲圖像清晰。 結論 在觀察心肌淀粉樣變中，烏龍茶提取物配合切片盒染色與改進后的制備方法，可以更加安全、快速地替代醋酸雙氧鈾進行透射電子顯微鏡電子染色。

[關鍵詞] 烏龍茶提取物;醋酸雙氧鈾;心肌淀粉樣變;透射電子顯微鏡

[中圖分類號] R737.14 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-7210（2019）10（a）-0017-04

Electron staining of myocardial amyloidosis by different preparation methods and tea instead of uranium

ZHAO Ranxu1 ? WEI Yingjie1? ?LI Li2 ? WANG Qingzhi2 ? LU Yang2 ? XU Hongyu2 ? YOU Yiwei2

1.Department of Electron Microscopy Platform of National Key Laboratory of Cardiovascular Diseases， Chinese Academy of Medical Sciences ?Peking Union Medical College ?National Center for Cardiovascular Diseases ?Fuwai Hospital， Beijing ? 100037， China; 2.Department of Pathology， ?Chinese Academy of Medical Sciences ?Peking Union Medical College ?National Center for Cardiovascular Diseases ?Fuwai Hospital， Beijing ? 100037， China

[Abstract] Objective To test whether oolong tea extract can be used as an electronic stain instead of uranyl acetate （UA） for myocardial amyloidosis staining. In the process of staining， different staining methods were used and improve the preparation methods and compare their safety and efficiency. Methods A total of 40 cases of clinically suspected amyloidosis were collected from Fuwai Hospital of the Chinese Academy of Medical Sciences from January to December 2017， and 10 cases of cardiac tissue positive after pathological observation and special staining. The myocardial tissues were prepared by conventional encapsulation and improvement of resin 812， and then two kinds of different stains （3% uranyl acetate solution， 0.5% oolong tea extract） were applied to the ultrathin section samples under the conditions of counterstaining lead or not counterstaining lead， and two different staining methods （drip method， slice box staining） electronic staining， and then the differences were compared under a transmission electron microscope. Results Under the condition of repeated staining of lead， the results of staining of amyloid substance in myocardium with two kinds of electron staining agents and the improved preparation method were all satisfactory. The background of the slice was clean， the contrast was high and the obtained image was clear. Conclusion In the observation of myocardial amyloidosis， oolong tea extract with section box staining and the improved preparation method can more safely and quickly replace dioxide-uranium acetate for transmission electron microscope electron staining.

[Key words] Oolong tea extract; Uranyl acetate; Myocardial amyloidosis; Transmission electron microscopy

透射電子顯微鏡簡稱透射電鏡，是醫學生物學研究的重要工具，在積累了一定的基礎研究數據后[1]，研究者們逐漸開始在人類心臟病組織中，使用透射電鏡技術對疾病超微結構的改變進行觀察。例如心肌淀粉樣變性，一類包括遺傳性或獲得性的疾病[2-4]，主要特征是錯誤折疊的蛋白質呈淀粉樣沉積在心臟?，F在這類代謝性疾病在心臟疾病中很常見，目前，心肌活檢標本的病理診斷多采用蘇木精-伊紅染色法輔以免疫組織化學的方法通過光學顯微鏡進行，但仍有部分病例難以明確診斷，需采用電鏡進行明確診斷。

20世紀50年代，華生首次將醋酸鈾用作電子顯微鏡染色劑[5-6]，此后它在電子顯微鏡染色中得到了廣泛的應用。但長時間以來，鈾對操作者健康的傷害，操作的繁瑣，儲存環境的要求之高以及廢液的處理不易等問題都沒有得到很好的解決，因此試圖尋找一種染色方法取代醋酸鈾的染色。為了解決前面提到的問題，一些研究者做了很多嘗試，Kajikawa等[7]使用單寧酸作為替代品，但使用單寧酸不能深入滲透到組織中，這個方法只能在薄片中使用。Tanaka（田中）和Nakamura（中村）[8]比較了四種電子染色方法，單寧酸染色、orcein染色、鈀氯化物染色劑和鐵蘇木精染色劑在超薄切片中的彈性纖維。結果提示單寧酸染色是最好的。2003年，Sato等[9]得出結果顯示烏龍茶提取物（OTE）染色方法在肺組織的觀察中優于丹寧酸。幾年后，Carpentier等[10]改進了這一方法，他們將這種方法結合到微波爐中觀察植物組織。OTE用作醋酸鈾的替代品已被用于某些領域，例如觀察動物組織植物組織和微孢子蟲。本研究使用了OTE[11-12]作為醋酸鈾的替代品，配合自制的染色器具，改進了制備方法，安全、快速地用于心肌淀粉樣變當中。

1 材料與方法

1.1 樣本收集

收集中國醫學科學院阜外醫院2017年1～12月臨床懷疑淀粉樣變性的病例40例，其中男28例，年齡22～73歲，平均（51.55±11.02）歲;女性患者12例，年齡35～68歲，平均（56.09±10.55）歲。10例患者心肌組織經病理學觀察和剛果紅染色呈陽性，其中男8例，年齡37～73歲，平均（55.13±10.35）歲;女2例，年齡52～65歲，平均（58.50±9.19）歲。以上實驗所取樣本通過了患者的知情同意。

1.2 主要試劑和儀器

1.2.1 主要試劑 ?醋酸鈾粉末（批號：71-031，中國國藥試劑）;OTE粉末（批號：日本特許5199220號，日本日新公司）。

1.2.2 主要儀器 ?透射電子顯微鏡（型號：JEM 1010，日本電子）;CCD（型號：Gatan 830，美國Gatan公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品制備方法 ?將懷疑心肌淀粉樣變的組織分為兩組，一組經過常規病理檢查，剛果紅染色陽性者列入本研究。檢測后相對應的另一組樣本，一種經常規812樹脂包埋法制樣;另一種用改進后的方法制備樣品。兩種方法制成的膠塊均進行連續超薄切片，待染色用。

1.3.2 超薄切片染色方法 ?使用滴染法：培養皿中鋪平封口膜，然后用一次性針管均勻滴上10滴染液，并試用不同染色劑染色。過程中要不斷更換封口膜。①3%醋酸鈾染液染色15～20 min。②0.5%的烏龍茶提取物緩沖液（pH 7.4）（0.1 mol/L的PBS配置而成）染色20～30 min。染色后，超薄切片分別用蒸餾水進行清洗，切片上水分稍干后把以上切片分成兩組：一組待用于直接觀察，一組進行檸檬酸鉛的復染15～20 min后進行觀察。

使用切片盒染色法：培養皿中灌注石蠟，在未干燥之前，用切片盒壓制出相符合的形狀，鑄成染色模具，然后把切片盒（北京中興百瑞技術有限公司）打孔，把待染切片依次，順序放入切片盒，進行如上染色，最后進行觀察。

1.4 電鏡觀察

所有切片均使用JEM 1010，在加速電壓80 kV下，用CCD進行觀察。

2 結果

2.1 光鏡檢測結果

40例心肌組織染色后證實有淀粉樣物質沉積者10例。見圖1（封四）。

2.2 不同試劑配伍染色結果

圖2可見，使用常規電鏡染色方法，鉛、鈾雙染法，在電鏡觀察不同倍數下（圖2A～C為傳統方法染色的心肌淀粉樣變整體圖，C圖設為陽性對照），可以清楚地將心肌組織中沉淀的淀粉樣物質染色。而只進行檸檬酸鉛單獨染色顯示結果呈陰性（圖2D）。醋酸雙氧鈾與檸檬酸鉛復染的心肌淀粉樣變圖，淀粉樣物質染色結果清晰（圖2E）。并且無論是單獨鈾染色（圖2F），還是烏龍茶提取物代替醋酸鈾配伍鉛的染色方法和茶單獨染色（圖2G～H），均可以將心肌組織中沉淀的淀粉樣物質染色。本實驗中，茶鉛的配伍染色不僅可以將淀粉樣物質染色，還可以將組織中的線粒體、肌絲、細胞間質等基本結構染色。加上鉛的復染，兩種染色結果（圖2E～I）均相同，淀粉樣物質清晰可見。

2.3 不同染色方法染色結果

在嚴格控制污染的情況下，用滴染法獨立完成連續50張超薄切片的染色，需要耗時約4.5 h，每種染液約消耗1 mL;切片盒法耗時約1 h，每種染液約消耗約10 mL。在電鏡下觀察，兩種染色方法的染色結果均較理想，切片背景干凈、對比度高，所獲圖像清晰。

在研究中采用改進后樣品制備方法比常規包埋方法縮短了2/3的時間（表1），制片后的染色結果相同。

3 討論

生物樣品的超薄切片染色在電鏡標本制備過程中十分關鍵[13-15]，然而染色不慎造成的切片污染、染色不均時有發生。為了得到滿意的染色結果，電鏡工作者開發了多種染色方法及裝置并不斷進行改進。本實驗室采用的就是簡易自制裝置——切片盒配伍石蠟模具，進行封閉式浸染。切片盒染色法的優點是銅網放置簡單、順序清楚、數量多，且每張銅網空間相對獨立，有效防止了切片錯亂及脫落，而且安全性及便利性較高。但沖洗需注意切片盒蓋與底板的小孔對齊，以保證清洗干凈，沖洗時間要較滴染法的時間稍延長。除此之外超薄切片的染色效果還受多種因素影響，如染色液的濃度、溫度、pH值;一些技術因素，如固定劑和嵌入媒體[16]。因此本研究改進樣品的制備方法，減少了步驟，節省了時間，用于茶代鈾的染色，更快速、安全地完成心肌活檢淀粉樣變的染色。既往的研究[17-19]表明OTE多酚不能進入細胞并傷害細胞膜，但它們的肽鍵反應和透射電子顯微鏡中的染色均增強。本研究結果提示，雖然采用OTE單染色和配伍鉛雙染色可以顯示大部分心肌組織結構，與傳統染色方法相比，一些結構仍然可以觀察到細節上的差異，但淀粉樣物質染色清晰，而且考慮到安全性因素，OTE是電子染色中醋酸鈾的非常有前景的替代品[20]。

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（收稿日期：2019-05-05 ?本文編輯：劉永巧）