HPLC法測定復方感冒靈流膏中7種成分的含量

李柯 陳丹 李軍 侯茜 戚建中 李若存

[摘要] 目的 建立同時測定復方感冒靈流膏中7種成分含量的高效液相色譜法。 方法 采用Kromasil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈-0.4%磷酸水溶液（梯度洗脫）為流動相，流速為1.0 mL/min，檢測波長327 nm，柱溫為30℃。 結果 新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸C、異綠原酸B、異綠原酸A、蒙花苷質量濃度分別在5.681～113.62 μg/mL（r = 0.9996）、6.42～128.4 μg/mL（r = 0.9995）、6.806～136.12 μg/mL（r = 0.9996）、3.924～78.48 μg/mL（r = 0.9996）、4.863～97.26 μg/mL（r = 0.9994）、2.273～45.46 μg/mL（r = 0.9991）、43.08～861.6 μg/mL（r = 0.9993）范圍內與峰面積呈良好的線性關系;平均加樣回收率（n = 6）分別為97.79%、98.24%、96.92%、97.84%、99.23%、99.00%、100.04%。 結論 所建立的高效液相色譜法能為復方感冒靈流膏的質量控制提供依據。

[關鍵詞] 復方感冒靈流膏;高效液相色譜法;新綠原酸;綠原酸;隱綠原酸;異綠原酸C;異綠原酸B;異綠原酸A;蒙花苷;質量控制

[中圖分類號] R286.0 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-7210（2019）10（a）-0035-05

Quantitative determination of seven components of Fufang Ganmaoling Fluid Extract by HPLC

LI Ke1 ? CHEN Dan2 ? LI Jun3 ? HOU Xi1 ? QI Jianzhong3 ? LI Ruocun1

1.Hu′nan Academy of Chinese Medicine， Hu′nan Province， Changsha ? 410013， China; 2.Xiangtan Medicine & Health Vocational College， Hu′nan Province， Xiangtan ? 411104， China; 3.Huarun Sanjiu （Chenzhou） Pharmaceutical Co.， Ltd.， Hu′nan Province， Chenzhou ? 423000， China

[Abstract] Objective To establish simultaneous determination of 7 components in Fufang Ganmaoling Fluid Extract method by high performance liquid chromatography. Methods Kromasil C18 column（4.6 mm×250 mm， 5 μm） column was used as the column， acetonitrile- 0.4% phosphoric acid solution was used as the mobile phase of the gradient elute， with the detection wavelength of 327 nm and the flow rate of 1.0 mL/min. The colomn temperature maintained at 30℃. Results The neochlorogenic acid， chlorogenic acid， cryptochlorogenic acid， 4，5-dicaffeoylquinic acid， 3，4-dicaffeoylquinic acid， 3，5-dicaffeoylquinic acid， in the range of 5.681-113.62 μg/mL （r = 0.9996）， 6.42-128.4 μg/mL （r = 0.9995）， 6.806-136.12 μg/mL （r = 0.9996）， 3.924-78.48 μg/mL （r = 0.9996）， 4.863-97.26 μg/mL （r = 0.9994）， 2.273-45.46 μg/mL （r = 0.9991）， 43.08-861.6 μg/mL （r = 0.9993） showed good linear relationship with the peak area. The average recovery rates （n = 6） of the seven components were 97.79%， 98.24%， 96.92%， 97.84%， 99.23%， 99.00% and 100.04% respectively. Conclusion The method could be used for the comprehensive quality control of Fufang Ganmaoling Fluid Extract.

[Key words] Fufang Ganmaoling Fluid Extract; High performance liquid chromatography; Neochlorogenic acid; Chlorogenic acid; Cryptochlorogenic acid; 4，5-dicaffeoylquinic acid; 3，4-dicaffeoylquinic acid; 3，5-dicaffeoylquinic acid; Buddleoside; Quality control

復方感冒靈顆粒由山銀花、五指柑等6味中藥和對乙酰氨基酚等3種西藥制成，功能為辛涼解表，清熱解毒，臨床用于風熱感冒及溫病之發熱，微惡風寒，頭身痛，口干而渴，鼻塞涕濁，咽喉紅腫疼痛，咳嗽，痰黃粘稠。本品療效確切，市場需求量大，國內有多家企業生產?，F有標準均未對中藥流膏與成品建立定性定量指標，不能有效控制產品質量，成為制約復方感冒靈顆粒產業發展亟待解決的問題[1]。流膏為連接中藥飲片與成品的橋梁，其質量與成品質量的均一性，療效的一致性密切相關。目前，關于復方感冒靈流膏質量控制方法的研究未見報道，在前期建立流膏（中間體）指紋圖譜的基礎上[2-3]，本試驗建立了HPLC法同時測定復方感冒靈流膏中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C[4-7]、蒙花苷[8-9]7種有效成分含量的方法，為復方感冒靈顆粒流膏（中間體）及成品的質量控制與評價提供依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀（2695型，美國Waters;LC-20A型，日本島津）。紫外檢測器（SPD-20A型，日本島津）。電子分析天平（XS205，瑞士Mettler Toledo，十萬分之一）。超聲波清洗器（KQ800-KDE，昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

復方感冒靈流膏由華潤三九（郴州）制藥有限公司提供，共取10批，批號分別為Z1701104、Z1701105、Z1701106、Z1701107、Z1701108、Z1701109、Z1701110、Z1701111、Z1701112、Z1701113，分別編號為S1～S10。蒙花苷對照品（批號：111528-201710，含量以96.6%計）、綠原酸對照品（批號：110753-201716，含量以99.3%計）購自中國食品藥品檢定研究院。新綠原酸對照品（批號：MUST-18031001，含量以99.67%計）、隱綠原酸對照品（批號：MUST-18032403，含量以99.07%計）、異綠原酸A對照品（批號：MUST-18032601，含量以98.82%計）、異綠原酸B對照品（批號：MUST-18031602，含量以99.05%計）、異綠原酸C對照品（批號：MUST-18031603，含量以99.84%計）均購自成都曼思特生物科技有限公司。乙腈為色譜純（購自Tedia公司），甲醇、乙醇均為分析純（長沙市匯虹化玻儀器設備有限公司），水為純凈水。

2 方法與結果

2.1 復方感冒靈流膏的制備

稱取山銀花104 g、五指柑415 g、野菊花310 g、三叉苦520 g、南板藍根310 g、崗梅835 g，加水煎煮2次，煎液合并濃縮至適量，加乙醇沉淀，濾過，濾液濃縮成流膏。

2.2 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）;流動相：乙腈（A）-0.4%的磷酸水溶液（B），梯度洗脫：0～20 min A：3%→15%，B：97%→85%;20～45 min A：15%→24%，B：85%→76%;45～55 min A：24%→35%，B：76%→65%;55～60 min A：35%→3%，B：65%→97%;60～65 min A：3%，B：97%。檢測波長：327 nm;柱溫：30℃;流速：1.0 mL/min;進樣量10 μL。

2.3 溶液的制備

2.3.1 對照品溶液 ?精密稱取7種對照品各適量，加50%甲醇制成濃度分別為綠原酸0.6420 mg/mL、新綠原酸0.5681 mg/mL、隱綠原酸0.6806 mg/mL、異綠原酸A 0.2273 mg/mL、異綠原酸B 0.4863 mg/mL、異綠原酸C 0.3924 mg/mL、蒙花苷4.3080 mg/mL的混合對照品溶液。再精密量取上述混合對照品溶液1 mL，置10 mL容量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，得到濃度分別為綠原酸64.20 μg/mL、新綠原酸56.81 μg/mL、隱綠原酸68.06 μg/mL、異綠原酸A 22.73 μg/mL、異綠原酸B 48.63 μg/mL、異綠原酸C 39.24 μg/mL、蒙花苷430.80 μg/mL的混合對照品溶液。

2.3.2 供試品溶液 ?稱取復方感冒靈流膏1.0 g，精密稱定，置150 mL錐形瓶中，加50%甲醇約50 mL，稱重，超聲處理（功率250 W，頻率50 kHz）30 min，冷卻，重新稱重，用50%甲醇補足失重，搖勻，濾過，即得。

2.3.3 空白對照溶液 ?按復方感冒靈流膏處方和制備工藝制備缺野菊花的空白樣品及缺山銀花、野菊花、五指柑及崗梅的空白樣品，并按“2.3.2”項下方法分別制成缺野菊花和缺山銀花、野菊花、五指柑及崗梅的空白對照溶液。

2.4 方法學考察

2.4.1專屬性試驗 ?分別精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液（S1）與空白溶液各10 μL，按“2.2”項下色譜條件，測定，即得。見圖1。

2.4.2 線性關系考察 ?精密吸取“2.3.1”項下混合對照品溶液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，各置10 mL容量瓶中，分別加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得一系列濃度的對照品溶液。按“2.2”項下色譜條件，測定，記錄峰面積。以對照品的質量濃度（μg/mL）為橫坐標、峰面積為縱坐標，進行線性回歸方程計算，結果見表1。

2.4.3 精密度試驗 ?取混合對照品溶液，按“2.2”項下色譜條件，連續進樣測定6次，以新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸C、異綠原酸B、異綠原酸A、蒙花苷峰面積計，RSD分別為1.52%、1.28%、1.67%、1.36%、1.12%、1.80%、2.66%，表明儀器精密度良好。

2.4.4 穩定性試驗 ?取供試品溶液（S1），分別于放置0、2、4、8、12、24 h，按“2.2”項下色譜條件，測定，以新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸C、異綠原酸B、異綠原酸A、蒙花苷峰面積計，RSD分別為1.25%、1.32%、1.64%、1.77%、1.51%、1.68%、1.94%，表明供試品溶液在24 h內保持穩定。

2.4.5 重復性試驗 ?取同一批樣品（S1）適量，按“2.3.2”項下方法制備6份供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件測定記錄峰面積。新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸C、異綠原酸B、異綠原酸A、蒙花苷含量平均值分別為2.75、3.18、3.36、1.84、2.15、0.82、12.64 mg/g，RSD分別為1.99%、1.67%、2.28%、2.09%、2.64%、2.41%、2.50%，表明本方法重復性良好。

2.4.6 重現性試驗 ?取同一批樣品（S1）適量，按“2.3.2”項下方法制備6份供試品溶液，采用高效液相色譜儀，紫外檢測器，按“2.2”項下色譜條件測定，記錄峰面積。新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸C、異綠原酸B、異綠原酸A、蒙花苷含量平均值分別為2.66、3.32、3.50、1.81、2.31、0.89、12.92 mg/g，RSD分別為1.82%、1.35%、2.06%、1.99%、2.72%、2.17%、2.32%，表明本方法中間精密度良好。

2.4.7 加樣回收率試驗 ?精密稱取同一批已知含量樣品（S1）6份，分別加入與供試液中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸C、異綠原酸B、異綠原酸A、蒙花苷約成1∶1對照品量，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項下色譜條件進樣，測定，計算樣品含量，并計算加樣回收率。見表2。

2.5 樣品含量測定

取10批復方感冒靈流膏，分別按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項下色譜條件測定樣品中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸C、異綠原酸B、異綠原酸A、蒙花苷含量。見表3。

3 討論

前期通過HPLC-Q-TOF-MS/MS對復方感冒靈流膏指紋圖譜中的主要色譜峰進行了結構鑒定，明確了流膏中的主要成分為綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C及蒙花苷[3，10-19]，因此，本試驗選擇上述7種成分作為流膏測定的指標性成分。鑒于綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C為方中山銀花、崗梅、五指柑、野菊花的共有成分，蒙花苷為野菊花的特有成分，因此在設計陰性對照時，制備了缺山銀花、崗梅、五指柑、野菊花四味藥材的陰性樣品及缺野菊花的陰性樣品。

本試驗用二極管陣列檢測器全波長掃描，各有機酸的最大吸收波長為（327±2）nm[20]，蒙花苷的最大吸收波長為334 nm[20]，分別采用327 nm與334 nm對7種成分進行含量測定，結果兩波長下測定的含量相差無異，但327 nm有機酸類的峰面積值均較大，因此選擇327 nm作為檢測波長。

研究表明，綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C有抗菌、抗炎、抗病毒、抗氧化、護肝作用[10-21]，蒙花苷有抗菌、抗氧化、護肝及抗血管炎癥損傷的作用[22-23]，這些成分均源自于本方中的山銀花、崗梅、五指柑、野菊花。本試驗首次建立了同時測定復方感冒靈顆粒流膏中蒙花苷、綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C的HPLC分析方法，該法靈敏度高，重復性好，結果可靠，操作簡單易行，為該產品的中間體健立了一個全面有效的質量控制方法。

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（收稿日期：2019-04-19 ?本文編輯：劉永巧）