基于腸道堿性磷酸酶相關(guān)信號通路探討針灸維持腸道菌群-免疫穩(wěn)定作用的機制

毛文姣 張紅梅

[摘要] 腸道微生物群的改變被認為腸易激綜合征（IBS）發(fā)病機制的病因。腸道菌群-免疫失調(diào)導致腸道微環(huán)境的改變，誘發(fā)腸道的低度炎癥。腸道堿性磷酸酶（IAP）通常能保護宿主免受腸道炎癥和主要在結(jié)腸內(nèi)的組織損傷，是維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定所必需的重要黏膜防御因子，被認為是腸道微生物群組成的潛在調(diào)節(jié)器。基于此，IAP相關(guān)通路可能是闡明針刺對腸道菌群-免疫穩(wěn)定作用分子生物學機制的新切入點，促進對從脾論治與調(diào)控腸道菌群關(guān)系的認識，豐富中醫(yī)從脾論治的科學內(nèi)涵。

[關(guān)鍵詞] 腸易激綜合征;腸道微生物;腸道堿性磷酸酶;腸道菌群-免疫失調(diào)

[中圖分類號] R246.1 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-7210（2019）10（a）-0126-04

Based on intestinal alkaline phosphatase signaling pathway to discuss the mechanism of acupuncture maintaining intestinal flora-immune stability

MAO Wenjiao1 ? ZHANG Hongmei2

1.Department of Acupuncture， the Second Hospital of Nanjing， Jiangsu Province， Nanjing ? 210003， China; 2.Department of Clinical Testing Center， the Second Hospital of Nanjing， Jiangsu Province， Nanjing ? 210003， China

[Abstract] The alteration of intestinal microflora is considered to be the cause of the pathogenesis of Irritable bowel syndrome （IBS）. Intestinal flora-immune disorders lead to changes in the intestinal microenvironment， which induce low-grade inflammation of the intestines. Intestinal alkaline phosphatase （IAP） considered as a potential regulator of intestinal microflora， protects the host from intestinal inflammation and tissue damage mainly in the colon， while is an important mucosal defense factor necessary to maintain the stability of the intestinal environment. Based on the above poinits， IAP-related pathway may be a new entry point to elucidate the molecular biological mechanism of acupuncture on intestinal flora-immune stability， to promote the understanding of the relationship between treatment from spleen and regulation of intestinal flora， and to enrich the scientific connotation of treatment from spleen in Chinese medicine.

[Key words] Irritable bowel syndrome; Intestinal microbiota; Intestinal alkaline phosphatase; Intestinal flora-immune disorders

腸道菌群-免疫異常導致多種疾病，腸易激綜合征（irritable bowel syndrome，IBS）是最常見的由腸道菌群異常引起的胃腸病之一，腸道菌群-免疫失調(diào)導致腸道微環(huán)境的改變，誘發(fā)腸道的低度炎癥[1]。腸道微生物群的改變被認為是IBS發(fā)病機制的病因[2]。中醫(yī)理論認為，腸道微生態(tài)平衡是脾主運化的主要生理特征，腸道菌群失調(diào)和中醫(yī)脾失健運互為因果。腸道炎癥破壞腸道內(nèi)平衡，并引起免疫介導的組織損傷。腸道堿性磷酸酶（intestinal alkaline phosphatase，IAP）是一種在腸道中表達的內(nèi)源性蛋白質(zhì)，被認為是一種免受定植細菌損傷的保護機制。IAP活性通常能保護宿主免受腸道炎癥和主要在結(jié)腸內(nèi)的組織損傷。IAP是維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定所必需的重要黏膜防御因子[3]。IAP被認為是腸道微生物群組成的潛在調(diào)節(jié)器[4]。越來越多的研究顯示，IAP缺乏是腸道炎癥性疾病發(fā)病的主要原因[5-7]。IAP缺乏會自發(fā)增加未感染動物腸道組織中的炎性細胞因子，包括白細胞浸潤、上皮層不連續(xù)等，并且能誘導杯狀細胞數(shù)量減少[8]。基于前期研究基礎，推測IAP相關(guān)通路可能是闡明針刺對腸道菌群-免疫調(diào)節(jié)的分子生物學機制新的切入點，能提高從脾論治與調(diào)控腸道菌群關(guān)系的認識，豐富中醫(yī)從脾論治的科學內(nèi)涵。

1 IAP在腸道菌群-免疫中起重要作用

1.1 IAP是維持腸道穩(wěn)態(tài)必需的腸黏膜防御因子

IAP是一種經(jīng)糖基磷脂酰肌醇鍵錨定于腸上皮細胞頂膜上的糖蛋白，位于十二指腸腸細胞刷狀緣的頂端微絨毛表面，通過磷脂酶活性釋放到腸腔中，并通過腸道進入結(jié)腸。胃腸道IAP的主要功能之一是調(diào)節(jié)十二指腸表面的碳酸氫鹽分泌和酸堿度，調(diào)節(jié)腸道長鏈脂肪酸（LCFA）的吸收，以及內(nèi)毒素脂多糖（LPS）的解毒作用，產(chǎn)生局部腸道和全身抗炎作用。IAP是腸內(nèi)營養(yǎng)維持的腸黏膜防御因子[9]。人類重組IAP目前正在進行臨床試驗的第2階段，清楚地表明該酶在治療降低GI疾病中的重要性[10]。當IAP敲除小鼠腸受到缺血性損傷時，觀察到細菌向腸系膜淋巴結(jié)轉(zhuǎn)位的增加[11]。另一項研究中，確定了IAP可以正向調(diào)節(jié)腸道微生物組的機制，即腸腔中磷酸化核苷酸的失活[12]。他們觀察到IAP敲除小鼠的管腔內(nèi)容物中的腺者三磷酸ATP比野生型小鼠更多[13]。此外，外源性IAP能夠逆轉(zhuǎn)ATP介導的細菌生長抑制[12，14]。在小鼠中施用外源性IAP顯示鼠傷寒沙門菌和艱難梭菌相關(guān)疾病活動的嚴重程度降低，IAP具有快速恢復腸道正常微生物群的能力[15]。

1.2 IAP影響菌群結(jié)構(gòu)與功能

腸道黏膜免疫由獲得性免疫和固有免疫兩部分組成。漿細胞產(chǎn)生和釋放的大量分泌型免疫球蛋白A（sIgA）是腸黏膜獲得性免疫的主要效應分子，潘氏細胞分泌的多種抗菌肽和杯狀細胞分泌的黏蛋白是固有免疫的主要活性成分[16]。IAP作為在腸道中表達的內(nèi)源性蛋白質(zhì)，通過以下途徑影響腸道免疫、調(diào)控菌群。

1.2.1 IAP→MUC2→腸道菌群 ?黏蛋白起作用在保護腸道屏障功能方面的重要作用[17]。IAP活性與黏蛋白顯著相關(guān)。MUC2缺乏導致IAP表達和脂多糖（LPS）解毒活性受損，缺乏導致腸道菌群易位、腸道菌群穩(wěn)態(tài)失調(diào)并誘發(fā)炎性反應[18]。

1.2.2 IAP→ZO-1→腸道菌群 ?腸道堿性磷酸酶是腸黏膜通透性的主要調(diào)節(jié)劑，是緊密連接蛋白（TJS）如ZO-1、claudin-1、claudin-2水平和緊密連接形成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[19]。研究發(fā)現(xiàn)，人類細胞中較高的IAP水平與ZO-1和ZO-2的表達增加有關(guān)，并且在動物研究中得到了相似的結(jié)果[20]。TJS是腸屏障最重要的組成部分，它負責維持無菌環(huán)境[21]。在這種微環(huán)境不平衡或屏障失效的情況下，細菌或細菌產(chǎn)品進入腸道的易位將激活免疫細胞并觸發(fā)炎性反應。

1.2.3 IAP→sIgA→腸道菌群 ?sIgA是腸腔微生態(tài)中重要的免疫球蛋白，在維護腸腔內(nèi)環(huán)境平衡中具有不可替代的作用。sIgA可很大程度地耐受腸腔內(nèi)的菌群蛋白酶，可以適當改善腸腔菌群的組成和維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。此外，結(jié)合分泌片后的IgA具有抵抗酶類降解的優(yōu)勢，這對于其在腸道中發(fā)揮更大免疫活性提供了便利。研究發(fā)現(xiàn)，IAP參與腸道特異性IgA產(chǎn)生和分泌，口服IAP補充劑對腸道持續(xù)分泌sIgA有深遠影響[22-23]。IAP功能缺失或被抑制等異常狀態(tài)下可見腸道菌群失調(diào)、腸道抗炎及自我修復功能受損。

2 去磷酸化LPS參與腸黏膜免疫屏障功能的維護和調(diào)節(jié)

2.1 腸道炎癥中去唾液酸化加速了IAP糖蛋白內(nèi)化和缺乏

IAP缺乏是腸道炎癥發(fā)生的主要因素。在沒有感染的情況下，附著在腸細胞表面新生IAP上的聚糖逐漸去唾液酸化。腸道炎癥發(fā)生時去唾液酸化的發(fā)生促進了腸細胞內(nèi)IAP分子老化，加速了IAP的降解速度。一種由革蘭陰性腸傷寒沙門菌反復出現(xiàn)的低度非致死性感染，導致了小鼠腸道組織的炎癥發(fā)生，這種抗炎機制主要在結(jié)腸內(nèi)起作用，但依賴于小腸十二指腸上皮細胞產(chǎn)生和釋放IAP，在發(fā)生ST感染時顯著增加了IAP脫唾液的基本速率，同時伴有腸細胞IAP內(nèi)化和降解的增加[8]。體外實驗研究證實在清除了多種感染的小鼠腸細胞樣本中，腸細胞表面IAP半衰期的顯著降低和培養(yǎng)基中IAP的豐度降低，并且早期內(nèi)體和溶酶體IAP標志物增加與細胞表面IAP豐度降低相一致[8]。

2.2 TLR4/MyD88/NF-κB相關(guān)信號通路是IAP調(diào)控重要信號途徑之一

先天免疫系統(tǒng)利用模式識別受體（PRRs），主要是Toll樣受體（TLRs），對細菌入侵提供主要宿主反應。LPS是革蘭陰性細菌外膜的外部脂質(zhì)層，它是構(gòu)成哺乳動物腸道微生物群的重要組成部分[24]。在脊椎動物中，這些磷酸鹽對于LPS與TLR4/MD-2先天免疫受體復合物的結(jié)合[25]，NF-κB信號傳導的起始和免疫應答誘導是重要的[26-27]。IAP可以將LPS的脂質(zhì)-A部分去磷酸化為無毒形式，破壞LPS內(nèi)毒素與TLR4信號傳導并抑制細胞因子的產(chǎn)生。IAP的缺失會導致更高的LPS流入系統(tǒng)循環(huán)，LPS的全身易位會引發(fā)過度的炎性反應，最終通過腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細胞介素（IL）-1、IL-6、IL-8和IL-12等促炎細胞因子[28-29]誘導敗血癥性休克。如果免疫反應嚴重但免疫水平較低[1]，它也可刺激與慢性炎癥性疾病相關(guān)的輕度慢性炎性反應[30-31]。IAP可能是針刺維持腸道菌群-免疫穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵靶點和重要機制。

3.1 電針可以改善腸道微生物的多樣性，修復腸道有益菌定植抗力

針灸在近年來治療IBS中效果顯著，研究發(fā)現(xiàn)，電針可以改善腸道微生物的多樣性，恢復腸道穩(wěn)態(tài)。研究中對25例IBS患者的糞便菌群進行16srDNA測序，通過與健康人比較發(fā)現(xiàn)IBS患者腸道菌群微生物多樣性下降、結(jié)構(gòu)異常。電針治療后IBS患者腸道微生物的多樣性增加，菌群失調(diào)情況改善，厚壁菌門/擬桿菌門比值降低，其余各水平失調(diào)菌群的相對豐富度普遍趨于正常，患者癥狀改善與菌群相對豐度變化存在相關(guān)性[32]。

3.2 針刺對TLR2/4-MyD88-NF-κB信號通路良性調(diào)節(jié)，參與腸道免疫應答

腸道免疫功能紊亂是IBS發(fā)病主要機制之一，細胞因子的異常表達與免疫系統(tǒng)的紊亂密切相關(guān)[33]。最新一項研究[34]評估了IBS-D患者針刺干預前后IBS患者血清TLR4、Myd88、NF-κB相關(guān)生物活性物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)IBS-D患者血清TLR4、Myd88、NF-κB水平明顯高于健康對照組。經(jīng)針刺干預后，TLR4、Myd88、NF-κB水平下降，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。

4 展望與思考

基于前期研究基礎及國內(nèi)外最新研究進展，我們提出了“電針對腸道菌群-免疫的穩(wěn)定作用是通過調(diào)節(jié)IAP相關(guān)通路實現(xiàn)的”的科學假說。未來的研究可從3個層次逐漸深入：①通過異種移植實驗建立腸道菌群免疫失衡IBS小鼠模型，證實IBS菌群失調(diào)狀態(tài)加速了IAP糖蛋白內(nèi)化和缺乏，導致腸屏障功能障礙及促炎因子釋放;②通過基因敲除技術(shù)獲得IAP-/-小鼠，觀察IAP在IBS腸道菌群-免疫失衡性的重要作用，探討電針對IAP的干預作用及調(diào)控途徑的機制研究，證實IAP相關(guān)通路可能是針刺維持腸道穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵途徑之一;③通過擴大樣本量、多中心合作方式闡明IAP相關(guān)通路在IBS發(fā)病中的作用，有助于闡明針灸作用基礎及作用機制。從以上3個層面驗證電針可以提高IAP活性，發(fā)揮對內(nèi)毒素脂多糖的解毒作用，調(diào)節(jié)腸道菌群，調(diào)節(jié)腸屏障功能，恢復腸道菌群-免疫的穩(wěn)定作用。為針灸治療IBS提供新的科學依據(jù)，進一步豐富針灸傳統(tǒng)理論的科學內(nèi)涵。

[參考文獻]

[1] ?Drossman DA. Functional Gastrointestinal Disorders：History，Pathophysiology，Clinical Features and Rome Ⅳ [J]. Gastroenterology，2016，150（6）：1262-1279.

[2] ?Su T，Liu R，Lee A，et al. Altered Intestinal Microbiota with Increased Abundance of Prevotella Is Associated with High Risk of Diarrhea-Predominant Irritable Bowel Syndrome [J]. Gastroenterol Res Pract，2018，2018：6961783.

[3] ?Lalles JP. Intestinal alkaline phosphatase：multiple biological roles in maintenance of intestinal homeostasis and modulation by diet [J]. Nutr Rev，2010，68（6）：323-332.

[4] ?Fawley J，Koehler S，Cabrera S，et al. Intestinal alkaline phosphatase deficiency leads to dysbiosis and bacterial translocation in the newborn intestine [J]. J Surg Res，2017，218：35-42.

[5] ?Martinez-Moya，P，Ortega-Gonzalez，M，Gonzalez，R，et al. Exogenous alkaline phosphatase treatment complements endogenous enzyme protection in colonic inflammation and reduces bacterial translocation in rats [J]. Pharmacol Res，2012，66（2）：144-153.

[6] ?Alpers DH，Zhang Y，Ahnen DJ. Synthesis and parallel secretion of rat intestinal alkaline phosphatase and a surfactant-like particle protein [J]. Am J Physiol，1995，268（6 PT 1）：E1205-E1214.

[7] ?Goldberg RF，Austen WG Jr，Zhang X，et al. Intestinal alkaline phosphatase is a gut mucosal defense factor maintained by enteral nutrition [J]. Proc Natl Acad Sci USA，2008，105（9）：3551-3556.

[8] ?Yang WH，Heithoff DM，Aziz PV，et al. Recurrent infection progressively disables host protection against intestinal inflammation [J]. Science，2017，358（6370）：eaao5610.

[9] ?Lalles JP. Intestinal alkaline phosphatase： novel functions and protective effects [J]. Nutr Rev，2014，72（2）：82-94.

[10] ?Fawley J，Gourlay DM. Intestinal alkaline phosphatase：a summary of its role in clinical disease [J]. J Surg Res，2016，202（1）：225-234.

[11] ?Goldberg RF，Austen WJ，Zhang X，et al. Intestinal alkaline phosphatase is a gut mucosal defense factor maintained by enteral nutrition [J]. Proc Natl Acad Sci USA，2008，105（9）：3551-3556.

[12] ?Malo MS，Moaven O，Muhammad N，et al. Intestinal alkaline phosphatase promotes gut bacterial growth by reducing the concentration of luminal nucleotide triphosphates [J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2014， 306（10）：G826-G838.

[13] ?Bates JM，Akerlund J，Mittge E，et al. Intestinal alkaline phosphatase detoxifies lipopolysaccharide and prevents inflammation in zebrafish in response to the gut microbiota [J]. Cell Host Microbe，2007，2（6）：371-382.

[14] ?Lalles JP. Luminal ATP：the missing link between intestinal alkaline phosphatase，the gut microbiota，and inflammation？ [J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2014，306（10）：G824-G825.

[15] ?Alam SN，Yammine H，Moaven O，et al. Intestinal alkaline phosphatase prevents antibiotic-induced susceptibility to enteric pathogens [J]. Ann Surg，2014，259（4）：715-722.

[16] ?Heneghan AF，Pierre JF，Kudsk KA. JAK-STAT and intestinal mucosal immunology [J]. JAKSTAT，2013，2（4）：e25530.

[17] ?Deplancke B，Gaskins HR. Microbial modulation of innate defense：goblet cells and the intestinal mucus layer [J]. Am J Clin Nutr，2001，73（6）：1131S-1141S.

[18] ?Cobo ER，Kissoon-Singh V，Moreau F，et al. Colonic MUC2 mucin regulates the expression and antimicrobial activity of beta-defensin 2 [J]. Mucosal Immunol，2015，8（6）：1360-1372.

[19] ?Liu W，Hu D，Huo H，et al. Intestinal Alkaline Phosphatase Regulates Tight Junction Protein Levels [J]. J Am Coll Surg，2016，222（6）：1009-1017.

[20] ?Hamarneh SR，Mohamed MM，Economopoulos KP，et al. A novel approach to maintain gut mucosal integrity using an oral enzyme supplement [J]. Ann Surg，2014，260（4）：706-715.

[21] ?Fries W，Belvedere A，Vetrano S. Sealing the broken barrier in IBD：intestinal permeability，epithelial cells and ?junctions [J]. Curr Drug Targets，2013，14（12）：1460-1470.

[22] ?Wang D，Zhou X，She R，et al. Impaired intestinal mucosal immunity in specific-pathogen-free chickens after infection with very virulent infectious bursal disease virus [J]. Poult Sci，2009，88（8）：1623-1628.

[23] ?Chen Z，Xie J，Wang B，et al. Effect of gamma-aminobutyric acid on digestive enzymes，absorption function，and ?immune function of intestinal mucosa in heat-stressed chicken [J]. Poult Sci，2014，93（10）：2490-2500.

[24] ?Yang Y，Wandler AM，Postlethwait JH，et al. Dynamic Evolution of the LPS-Detoxifying Enzyme Intestinal Alkaline Phosphatase in Zebrafish and Other Vertebrates [J]. Front Immunol，2012，3：314.

[25] ?Park BS，Song DH，Kim HM，et al. The structural basis of lipopolysaccharide recognition by the TLR4-MD-2 complex [J]. Nature，2009，458（7242）：1191-1195.

[26] ?Yamamoto M，Akira S. Lipid A receptor TLR4-mediated signaling pathways [J]. Adv Exp Med Biol，2010，667：59-68.

[27] ?Huhta H，Helminen O，Kauppila JH，et al. The Expression of Toll-like Receptors in Normal Human and Murine Gastrointestinal Organs and the Effect of Microbiome and Cancer [J]. J Histochem Cytochem，2016，64（8）：470-482.

[28] ?Fawley J，Gourlay DM. Intestinal alkaline phosphatase：a summary of its role in clinical disease [J]. J Surg Res，2016，202（1）：225-234.

[29] ?Dolowschiak T，Mueller AA，Pisan LJ，et al. IFN-gamma Hinders Recovery from Mucosal Inflammation during Antibiotic Therapy for Salmonella Gut Infection [J]. Cell Host Microbe，2016，20（2）：238-249.

[30] ?Estaki M，Decoffe D，Gibson DL. Interplay between intestinal alkaline phosphatase，diet，gut microbes and immunity [J]. World J Gastroenterol，2014，20（42）：15650-15656.

[31] ?Gunnarsson J，Simren M. Peripheral factors in the pathophysiology of irritable bowel syndrome [J]. Dig Liver Dis，2009，41（11）：788-793.

[32] ?徐萬里.基于腸道菌群-SCFAs-宿主互動理論探討“調(diào)神健脾”針法對IBS-D患者內(nèi)臟高敏感調(diào)節(jié)機制[D].南京：南京中醫(yī)藥大學，2016.

[33] ?李丹丹.基于TLR2/4-MYD88-NF-κb信號通路研究調(diào)神健脾針刺法治療腹瀉型腸易激綜合征的機制[D].南京：南京中醫(yī)藥大學，2018.

[34] ?梁世杰.調(diào)神健脾針刺法對腹瀉型腸易激綜合征患者下丘腦-垂體-腎上腺軸的影響[D].南京：南京中醫(yī)藥大學，2017.

（收稿日期：2019-06-25 ?本文編輯：王曉曄）