大蒜素對大鼠腎間質纖維化干預作用及對腎組織TGF-β1/Smads 信號通路的影響

李希敏 徐 露 周 璐 邵田娛 梁珍珍

腎間質纖維化是各種致病因素引起的進行性腎損傷的主要病理特征，也是導致終末期腎臟病的共同進程，然而目前臨床尚缺乏有效的治療方法逆轉這一過程。大蒜素化學名為二烯丙基三硫化物，是由大蒜經水蒸汽蒸餾而得到的一種揮發油，也可通過人工合成。近年來，國內外均有關于大蒜素對各類腎損傷的保護作用研究[1-2]。實驗研究證明，大蒜素對心肌、肝臟以及肺組織纖維化具有抑制作用，因此推測大蒜素對腎臟的間質纖維化同樣具有改善效果[3-4]。本研究采用單側輸尿管結扎術（UUO）制備大鼠腎間質纖維化模型，觀察大蒜素對大鼠腎間質纖維化的干預作用，初步探討其作用與TGF-β1/Smads 信號通路的關系。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 雄性SD 大鼠18 只，清潔級，體質量（150±20）g，由上海西普爾必凱實驗動物有限公司提供，合格證號：SCXK（滬）2018-0006，于浙江中醫藥大學動物實驗中心飼養，許可證號：SYXK（浙）2018-0012，實驗動物倫理批件號ZSLL-2018-033，屏障環境，室溫20～26℃，濕度40%～70%，自由食水，7 天后用于實驗。

1.2 藥品與試劑 大蒜素（98%，25g）：上海源葉生物科技有限公司（批號S25256）；Masson 染色液：南京建成科技有限公司（批號D026-1-2）；小鼠抗人轉化生長因子-β1（TGF-β1）單克隆抗體：Santa Cruz公司（批號SC65378）；兔抗人磷酸化信號轉導分子2（p-Smad2）單克隆抗體、羊抗人磷酸化信號轉導分子3（p-Smad3）多克隆抗體、兔抗人α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）單克隆抗體：杭州華安生物技術有限公司（批號ET1702-34，ET1607-43，ET1609-41）；DAB 試劑盒：北京中杉金橋生物技術有限公司（批號ZLI-9018）；HRP 標記羊抗鼠二抗、兔二抗：Proteintech 公司。

1.3 主要儀器與設備 STP120 脫水機、AP280-2 包埋機、HM335E 切片機：MICROM 公司；BG-270 隔水式電熱恒溫箱：上海博迅實業有限公司醫療設備廠；蛋白電泳系統：Bio-Rad 公司。

2 實驗方法

2.1 分組及腎間質纖維化模型建立 18 只SD 大鼠按照隨機數字表法分為假手術組、模型組與大蒜素組，每組6 只，采用UUO 建立大鼠腎間質纖維化模型。大鼠禁食24h 后，行腹腔麻醉，消毒，取左側腹部切口，暴露左側腎臟，用鑷子分離出輸尿管，于中上1/3 處結扎并剪斷，致左腎完全梗阻，將腎臟置于原位后，逐層縫合大鼠腹壁。假手術組僅分離輸尿管后直接縫合。

2.2 給藥 自造模術后第1 天，大蒜素組大鼠予大蒜素60mg·kg-1·d-1灌胃處理，假手術組及模型組每天予等量生理鹽水灌胃。第14 天，將所有大鼠放入代謝籠中，收集24h 尿液，隨后將大鼠麻醉，經心臟取血，行腎臟原位灌洗去除血液，取下左腎并稱重，將腎臟沿長軸剖開，一部分組織固定于10%中性福爾馬林緩沖液，用于制備病理切片，另一部分保存于-80℃冰箱，用于蛋白質分析。

2.3 觀察指標

2.3.1 體質量及腎臟指數 分別于造模后當天稱量大鼠體質量，第15 天稱量大鼠體質量及左腎質量，計算腎臟指數[腎臟指數=左腎質量（g）/體質量（g）×100%]。

2.3.2 血肌酐（SCr）、尿素氮（BUN）及24h 尿蛋白檢測 采用尿蛋白試劑盒對尿液樣本進行24h 尿蛋白定量測定，采用全自動生化分析儀測定血清樣本的SCr 和BUN。

2.3.3 腎組織病理觀察 對部分腎組織進行常規脫水，石蠟包埋、切片及Masson 染色，置于光學顯微鏡下觀察腎間質的纖維化情況。

2.3.4 腎組織TGF-β1、α-SMA 檢測 運用免疫組化法分析腎組織TGF-β1 及α-SMA 表達。方法：將石蠟切片放置60℃烤箱烘烤2h，脫蠟、水化，蒸餾水洗滌后，將切片浸入修復液，高壓熱修復，加入3%H2O2溶液10min，阻斷過氧化物酶，PBS 洗滌5min，3次。加入一抗，37℃下孵育60min，PBS 洗滌后加入二抗，孵育60min，DAB 顯色1～2min，復染，透明后封片。將切片置于光學顯微鏡下觀察并掃描，借助Image J 圖像分析軟件，每張切片隨機選取10 個視野（×400），計算平均光密度值（AOD）[AOD=累積光密度值（IOD）/陽性面積（Area）]，代表TGF-β1 和α-SMA 表達程度。

2.3.5 Western blot 分析 應用Western blot 法檢測大鼠腎組織p-Smad2 和p-Smad3 表達量。方法：取-80℃留存組織剪碎后，超聲粉碎，加入含有苯甲基磺酰氟（PMSF）的裂解液30min 提取對應蛋白，蛋白存儲于-20℃冰箱。按照BCA 試劑盒步驟在96 孔板中加入試劑，酶標儀測算蛋白含量，用去離子水和5×loading buffer 配置成蛋白總含量為5mg/mL 的樣品，100℃5min 水浴變性。在預制膠中加入每孔10μL的樣品和預染marker，電泳100V，1h，轉膜220mA，2h，封閉液封閉1.5h，敷一抗4℃搖床110rpm 過夜，洗膜10min×3 次，敷辣根過氧化物酶標記的二抗常溫搖床40rpm 2h，洗膜3 次后，用ECL 顯影劑曝光。運用Image J 軟件分析每個條帶的灰度值，與GAPDH 條帶的比值作為相對表達量。

2.4 統計學方法 應用SPSS 22.0 軟件處理數據，計量資料均以均數±標準差（±s）表示，組間差異比較采用單因素方差（One-way ANOVA）分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 各組大鼠體質量及腎臟指數比較 造模后當天三組大鼠體質量比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。造模后第15 天，模型組大鼠體質量顯著低于假手術組（P＜0.05），腎臟質量及腎臟指數均顯著高于假手術組（P＜0.01）；大蒜素組大鼠體質量顯著高于模型組（P＜0.05），腎臟指數顯著低于模型組（P＜0.01），與假手術組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

3.2 各組大鼠血SCr、BUN 及24h 尿蛋白比較 干預結束后模型組大鼠血SCr、BUN、24h 尿蛋白均顯著高于假手術組（P 均＜0.01）；大蒜素組大鼠血SCr、BUN 及24h 尿蛋白均低于模型組（P＜0.05 或P＜0.01）。見表2。

表1 各組大鼠體質量與腎臟指數比較（±s）

表1 各組大鼠體質量與腎臟指數比較（±s）

注：與假手術組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；大蒜素組：大蒜素60mg·kg-1·d-1 灌胃；假手術組與模型組：等量生理鹽水灌胃

表2 各組大鼠血SCr、BUN 及24h 尿蛋白比較（±s）

表2 各組大鼠血SCr、BUN 及24h 尿蛋白比較（±s）

注：與假手術組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；SCr：血清肌酐；BUN：血尿素氮；U-TP：24h 尿蛋白；大蒜素組：大蒜素60mg·kg-1·d-1 灌胃；假手術組與模型組：等量生理鹽水灌胃

3.3 腎臟病理觀察 使用光學顯微鏡觀察三組大鼠的Masson 染色切片，假手術組未見異常，模型組大鼠腎間質明顯增寬，部分腎小管擴張、萎縮，存在大量藍色纖維化灶，提示大鼠腎間質纖維化模型建立成功；與模型組比較，大蒜素組大鼠腎間質紊亂程度較輕，纖維化面積較小。見插頁圖1。

圖1 大鼠腎組織病理觀察（Masson 染色×200）

3.4 各組大鼠腎組織TGF-β1、α-SMA 蛋白表達量比較 假手術組大鼠腎組織TGF-β1 與α-SMA 蛋白免疫組化染色僅見少量棕色顆粒沉積，模型組棕色面明顯增大，與模型組比較，大蒜素組陽性物質沉積相對減少。半定量法分析顯示，模型組TGF-β1 與α-SMA 蛋白表達量顯著高于假手術組（P＜0.01），大蒜素組TGF-β1、α-SMA 量顯著低于模型組（P＜0.01），但高于假手術組（P 均＜0.01）。見表3、插頁圖2。

圖2 大鼠腎組織TGF-β1 與α-SMA 表達（免疫組化DAB 染色×200）

表3 各組大鼠腎組織TGF-β1、α-SMA 蛋白表達情況比較（±s）

表3 各組大鼠腎組織TGF-β1、α-SMA 蛋白表達情況比較（±s）

注：與假手術組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01；TGF-β1：轉化生長因子-β1；α-SMA：α-平滑肌肌動蛋白；大蒜素組：大蒜素60mg·kg-1·d-1 灌胃；假手術組與模型組：等量生理鹽水灌胃

3.5 各組大鼠腎組織p-Smad2、p-Smad3 蛋白表達量比較 模型組大鼠腎組織p-Smad2 與p-Smad3蛋白表達量高于假手術組（P 均＜0.01），與模型組比較，大蒜素組p-Smad2、p-Smad3 表達量較低（P 均＜0.01），但高于假手術組（P 均＜0.01）。見表4、插頁圖3。

圖3 大鼠腎組織p-Smad2 與p-Smad3 表達（Western Blot）

表4 各組大鼠腎組織p-Smad2/3 蛋白表達量比較（±s）

表4 各組大鼠腎組織p-Smad2/3 蛋白表達量比較（±s）

注：與假手術組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01；p-Smad2：磷酸化信號轉導分子2；p-Smad3：磷酸化信號轉導分子3；大蒜素組：大蒜素60mg·kg-1·d-1 灌胃；假手術組與模型組：等量生理鹽水灌胃

4 討論

腎間質纖維化是以過量細胞外基質（ECM）在腎間質積聚、腎臟組織結構破壞、功能喪失為主要特征的病理改變，臨床上根據纖維化的進展程度分為三期，一旦進入纖維形成后期或瘢痕形成期，則難以通過治療逆轉。腎纖維化病理涉及炎癥反應、氧化應激反應增強、腎臟固有細胞及免疫細胞的凋亡、促/抑纖維化細胞因子失衡等多個環節。研究證明，多種細胞因子對該過程具有調節作用，如轉化生長因子-β（TGF-β）、血小板衍生生長因子（PDGF）、結締組織生長因子（CTGF）能夠促進細胞外基質（ECM）的積聚，而肝細胞生長因子（HGF）、骨形成蛋白（BMP-7）具有抑制作用[5]。

TGF-β1 的下游靶點涉及MAPKs、Smads、PKA、PKC、Ca2+等通路，以上各因子間相互調控，構成復雜的網絡關系，其中Smads 蛋白作為中介分子，被認為在TGF-β1 信號傳導至細胞核的過程中起到關鍵作用。研究表明，Smad2/3 參與ECM 合成與降解的相關基因的表達調控：TGF-β1 與TβRⅠ受體結合后，激活TβRⅡ受體的絲氨酸/蘇氨酸激酶，使Smad2/3磷酸化，p-Smad2/3 與Smad4 形成活性的轉錄復合物進入核內，促進PAI-1 和Ⅶ膠原基因的表達，進而增加ECM 的合成并減少其降解[6-7]。α-SMA 是肌成纖維細胞的標志蛋白，其含量與組織纖維化程度直接相關[8]。

大蒜素是大蒜中主要生物活性成分的總稱，國內外均有研究證明，大蒜素對不同致病因素導致的腎損傷具有保護作用[1-2]。另外，大蒜素能夠對不同臟器組織的纖維化起到一定的改善作用。李少春等[9]通過實驗證實，大蒜素能夠減少心肌細胞TGF-β1 和Smad3 表達，促進Smad7 表達，減輕心肌纖維化的程度；曾玉蘭[4]等研究表明，大蒜素通過下調TGF-β1和成纖維細胞α-SMA 的表達，從而干預大鼠肺纖維化的發生。本研究借助UUO 制備的腎間質纖維化大鼠模型，證明大蒜素干預能夠減輕大鼠的腎間質纖維化程度，改善其腎功能，作用機制可能與降低TGF-β1 在腎組織表達，抑制Smad2、Smad3 磷酸化，從而減少ECM 的生成相關。