正交實驗法優選咳喘合劑的提取工藝

婁成龍 王 瑩 沈曉春 杜 靜

咳喘合劑是杭州市紅十字會醫院的臨床經驗方，由蜜麻黃、蜜款冬花、蜜紫菀、浙貝、黃芩、前胡、甘草等12 味中藥組成，具有宣肺平喘，止咳化痰的功效，臨床用于小兒急慢性支氣管炎、哮喘、過敏性咳嗽及上呼吸道感染、感冒后癢咳等癥。為了規范咳喘合劑的提取工藝，確保制劑的療效，根據處方中藥物各組分的理化性質及藥理特點，結合中醫臨床用藥經驗，采用正交實驗法對咳喘合劑進行了提取工藝的優選研究，為咳喘合劑的制備提供依據[1-2]。

1 實驗材料

1.1 儀 器 AL204 型電子分析天平(梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司)；R502B 型旋轉蒸發儀（上海申勝生物技術有限公司）；SHB-Ⅲ-A 型循環水式真空泵（杭州大衛科教儀器有限公司）；HH6 型恒溫水浴鍋（金壇市江南儀器廠）；2F-1 型電熱鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；KQ-500DB 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；U3000 型美國戴安液相色譜（戴安中國有限公司）。

1.2 試 藥 咳喘合劑（批號180711）；飲片：丹參（批號171108），甘草（批號170717），蜜紫菀（批號171221），黃芩（批號171112），桑白皮（批號171225），燀苦杏仁（批號170305），蜜款冬花（批號180615），焦六神曲（批號180529），前胡（批號180323），浙貝母（批號180328），炒紫蘇子（批號161013），均來自浙江惠松制藥有限公司；黃芩苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號110715-201720，純度93.5%），甲醇、磷酸均為色譜純，水為超純水，其余試劑為分析純。

2 方法與結果

2.1 黃芩苷HPLC 含量測定方法的建立[3]

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Diamonsil C18（4.6mm×250mm，5μm）；柱溫：25℃;檢測波長：280nm；流速:1.0mL/min；流動相：甲醇-水-磷酸（47：53：0.2）；進樣量：10μL。

2.1.2 溶液制備 對照品溶液的制備：稱取黃芩苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成濃度為0.01857mg/mL 的黃芩苷對照品溶液。供試品溶液的制備：精密量取本品5mL，置100mL 容量瓶中，加70%乙醇適量超聲處理（250W，40kHz）30min，放冷，定容至刻度，搖勻，精密量取續濾液1mL 置10mL 量瓶中，加70%乙醇至刻度，搖勻，經0.45un 的微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.1.3 方法學考察

2.1.3.1 專屬性試驗 按咳喘合劑處方比例及工藝，同法制成不含黃芩的陰性樣品，精密吸取黃芩苷對照品、供試品及陰性樣品溶液各10μL，按“2.1.1”項下色譜條件進樣。結果表明陰性樣品溶液無干擾，方法專屬性良好。見圖1-3。

圖1 黃芩苷對照品高效液相色譜圖

圖2 咳喘合劑樣品色譜圖

圖3 陰性對照色譜圖

2.1.3.2 線性關系考察 精密吸取“2.1.2”項下黃芩苷照品溶液。逐級稀釋共得5 份對照品溶液系列，濃度依次為：0.01857μg/mL、0.09285μg/mL、0.14856μg/mL、0.18570μg/mL、0.22284μg/mL，在“2.1.1”項色譜條件下，分別精密吸取上述對照品溶10μL 注入液相色譜儀。以峰面積（Y）對濃度（μg/mL，X）線性回歸，回歸方程：Y=3，502.536X-3.380，相關系數：R2=1.000，在0.01857～0.22284mg/mL 范圍內，對照品的峰面積與進樣濃度有良好的線性關系。

2.1.3.3 精密度實驗 精密吸取“2.1.2”項下黃芩苷對照品溶液，重復進樣5 次，按“2.1.1”項下色譜條件測定，測定黃芩苷RSD 為0.21%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.1.3.4 穩定性考察 取咳喘合劑（批號180711），按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，于0，2，4，8，12，24h，按“2.1.1”項下色譜條件測定，黃芩苷RSD為0.46%（n=6），表明供試品溶液在24h 內基本穩定。

2.1.3.5 重復性試驗 取同一供試品咳喘合劑（批號180711），按“2.1.2”項下的方法，制備6 份供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件測定。結果表明，以黃芩苷為參照峰，各共有峰相對保留時間RSD＜1.34%，表明方法重復性良好。

2.1.3.6 加樣回收率試驗 取同一供試品咳喘合劑（批號：180711），按“2.1.2”項下的方法，制備6 份供試品溶液，分別加入一定量黃芩苷對照品，按“2.1.1”項下色譜條件測定。計算得平均回收率為100.73%，RSD 為1.38%（n=6），加樣回收率良好。

2.2 出膏率的測定[4]精密量取各實驗的咳喘合劑煎液適量置于已干燥至恒重的蒸發皿中，水浴蒸干，于105℃干燥3h，取出，置干燥器中冷卻30min，迅速精密稱定重量，計算出膏率。

2.3 正交實驗設計[5-7]按處方比例稱取蜜麻黃、蜜款冬花、蜜紫菀、浙貝、黃芩、前胡、甘草等藥材共9份，每份106g，在預實驗基礎上，選取煎煮次數、加水量、煎煮時間和煎煮溫度進行考察，各因素水平（見表1），采用L9（34）正交表安排實驗，正交設計及正交試驗結果（見表2），方差分析見表3。

表1 考察因素及水平

表2 正交試驗表L9（34）及其試驗結果

表3 方差分析

2.4 正交試驗結果分析 由表3 可見，影響煎煮效果的因素順序為：C＞D＞A＞B。選擇偏差平方和最小的因素B（煎煮時間）為誤差項，C（煎煮次數）有顯著性差異，A（加水量）和D（溫度控制）無顯著性差異。綜合分析得最佳煎煮工藝為A3B2C3D3，即加水量12（10，10）倍，提取時間1（0.5，0.5）h，提取3 次，100℃煮沸?？紤]大生產的能耗問題及第3 煎的效價比，實際生產提取2 次，第1 次1h，第2 次0.5h，100℃煮沸，且由于加水量不是顯著性因素，故實際生產加水量第1 次10 倍，第2 次8 倍，即優選煎煮工藝為A2B2C2D3。

2.5 驗證試驗 按優化的實驗條件提取處方量的各味藥材，按照優選的提取工藝條件進行3 次驗證試驗，測定黃芩苷含量和出膏率，結果見表4。

對驗證結果要進行總結分析：由驗證實驗結果可知，黃芩苷平均含量為80.202mg/g，RSD 值0.79%；平均出膏率為30.47%，RSD 值0.57%。說明優選出的最佳工藝參數重現性好，工藝穩定。

表4 驗證試驗結果

3 討論

咳喘方原為草藥的水煎方，對小兒咳喘在臨床上已取得良好的療效。中藥合劑可發揮中藥的綜合作用，吸收快、奏效迅速、可批量生產；既保留傳統湯劑起效快的特點，又克服其服用、攜帶不便的缺點，省去臨時配方和煎煮的麻煩，同時改善口感。咳喘合劑的制備選用水作為提取溶劑，可以最大程度保留原湯劑的煎藥方式，同時還可以避免物質基礎發生改變的風險。

由于咳喘合劑的服用人群是兒童，而該方中主要由苦杏仁、黃芩、浙貝等多種味苦的中藥組成，加蜂蜜不僅可以調和口感，其補氣益肺，潤肺止咳的功效[8]也與咳喘合劑的主治功效相近，可以起到協同增效的作用，故用它作為矯味劑。同時，為了便于保存，在符合藥典規定標準的前提下，選用了羥苯乙酯作為防腐劑，提高抑菌防腐的效力[9]。

在前期的預實驗中，曾以君藥麻黃[10]中的鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿，君藥炒蘇子中的迷迭香酸作為監測指標，但在成品中含量都很低，均低于萬分之二；而黃芩中的黃芩苷在成品中含量較高，為確保實驗數據的準確性，故以黃芩苷含量（mg/1g 黃芩飲片）為考察指標；此外，中藥是通過組方配伍產生相應的功效，其有效成分復雜多樣，故以出膏率作為優選工藝的另一個參考指標，進行數據分析，選出最佳煎煮工藝。

通過正交實驗數據分析及結合生產實際，咳喘合劑的最佳制備工藝為處方飲片加水煎煮2 次，第1次1h，第2 次0.5h，加水量，第1 次10 倍，第2 次8倍，濾過，合并煎液濃縮，添加蜂蜜和羥苯乙酯，靜置過夜，濾過，灌裝，滅菌即得。驗證試驗結果表明，優選的工藝合理、穩定、可行，可用于咳喘合劑的生產制備。