杭菊滅菌方式與再生植株體系的探討

孟肖，陳娜，程磊，姚潔

(亳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院 藥學(xué)院，安徽 亳州 236800)

菊花來(lái)源于菊科植物菊(Chrysanthemummorifolium)的干燥頭狀花序。藥材按產(chǎn)地和加工方法不同，分為亳菊、滁菊、貢菊、杭菊、懷菊[1]。其中，杭菊主產(chǎn)于浙江，為我國(guó)藥茶兩用菊花，首載于明代《萬(wàn)歷嘉善縣志》，距今約有400 a栽培歷史。其花瓣潔白如玉，花蕊黃如純金，為道地藥材“浙八味”之一，素有“西湖龍井，杭白貢菊”之美譽(yù)。杭菊繁殖過(guò)程中主要采用分根和扦插2種方式進(jìn)行，長(zhǎng)期的無(wú)性繁殖使得杭菊攜帶多種病菌，植株在生長(zhǎng)過(guò)程中出現(xiàn)大面積的死亡，嚴(yán)重制約著杭菊的發(fā)展。傳統(tǒng)的繁殖方式已不能滿(mǎn)足急劇增長(zhǎng)的市場(chǎng)需要，杭菊再生體系研究逐漸受到重視。再生體系的外植體多取自田間，表面上附著大量的微生物，因此，外植體滅菌成為組織培養(yǎng)的一大障礙。本文主要對(duì)杭菊組培過(guò)程中的滅菌方式進(jìn)行研究，為后期杭菊再生體系的建立與組織快速繁殖技術(shù)提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)于2017年3—6月在亳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院組織培養(yǎng)室進(jìn)行。杭菊材料采自亳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥用植物園，經(jīng)程磊副教授鑒定為杭菊(ChrysanthemummorifoliumRamat.)。選生長(zhǎng)健壯無(wú)病蟲(chóng)害的杭菊植株，取當(dāng)年生的幼嫩帶尖莖段約10 cm作為外植體。

1.2 處理設(shè)計(jì)

1.2.1 材料預(yù)處理

將剪取的嫩莖帶回實(shí)驗(yàn)室，用自來(lái)水沖洗去除表面灰塵，再用洗衣粉浸泡約20 min，最后用流水洗凈，放入無(wú)菌的三角瓶中等待滅菌。

1.2.2 滅菌方式

在無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)，對(duì)外植體進(jìn)行滅菌[2-3]：先用70%乙醇浸泡20～30 s，無(wú)菌水沖洗3次，再用0.1% HgCl2溶液處理6～8 min，無(wú)菌水沖洗5次。將材料切成1～2 cm的帶尖莖段，接入滅菌好的MS培養(yǎng)基中，每組接種20瓶，每瓶接種4個(gè)外植體。接種20 d后，調(diào)查每組植株的生長(zhǎng)情況，包括基本形態(tài)、存活率、污染率。本試驗(yàn)重復(fù)3次，統(tǒng)計(jì)結(jié)果取3次的平均值。

1.2.3 增殖培養(yǎng)

將獲得的無(wú)菌側(cè)芽從外植體上輕輕切下，接入增殖培養(yǎng)基中，每瓶接種2棵。增殖培養(yǎng)以MS為基本培養(yǎng)基(含25 g·L-1蔗糖、8 g·L-1瓊脂粉)[4]，添加不同濃度的6-BA和NAA (6-BA的1、2、3水平分別為1.0、2.0、3.0 mg·L-1，NAA的1、2、3水平分別為0.1、0.2、0.3 mg·L-1)，培養(yǎng)20 d后觀察增殖情況。

1.2.4 生根培養(yǎng)

選擇增殖的杭菊試管苗，切去基部的愈傷組織，接入到生根培養(yǎng)基中，以MS為基本培養(yǎng)基(含25 g·L-1蔗糖、8 g·L-1瓊脂粉，1.0 mg·L-16-BA)，添加不同濃度的NAA和IBA(NAA的1、2、3水平分別為0.1、0.2、0.3 mg·L-1，IBA的1、2、3水平分別為0、0.05、0.10 mg·L-1)。每個(gè)處理接種10瓶，每瓶接種5棵，培養(yǎng)14 d后統(tǒng)計(jì)生根情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體培養(yǎng)

外植體滅菌接種1 d后，部分植株出現(xiàn)泛黃、萎蔫現(xiàn)象；接種3 d后，部分植株出現(xiàn)細(xì)菌或真菌感染；接種7 d后，部分植株側(cè)芽長(zhǎng)出；接種15 d后，外植體情況基本穩(wěn)定。滅菌并接種20 d后對(duì)試驗(yàn)植株進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。由表1可以看出，隨70%乙醇和0.1% HgCl2滅菌時(shí)間延長(zhǎng)，外植體污染率顯著降低，但也導(dǎo)致外植體逐漸萎蔫、死亡率逐漸增加。其中，70%乙醇滅菌25 s結(jié)合0.1% HgCl2溶液浸泡7 min處理的污染率為18.8%，死亡率為10%，滅菌效果比其他8組處理好(圖1)。

表1 杭菊不同滅菌方式的死亡率和污染率

圖1 杭菊外植體形態(tài)(培養(yǎng)20 d)和培養(yǎng)后形成的叢生芽

2.2 增殖培養(yǎng)

切取上述處理的植株側(cè)芽分別轉(zhuǎn)接到9種培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖，培養(yǎng)14 d觀察植株增殖情況。外植體出現(xiàn)2種生長(zhǎng)方式：①在外植體基部形成愈傷組織，經(jīng)過(guò)分化進(jìn)而長(zhǎng)出叢生芽；②外植體基部直接長(zhǎng)出叢生芽，且生長(zhǎng)迅速。不同培養(yǎng)基中杭菊分化的方式有一定區(qū)別： 6-BA濃度為2.0 mg·L-1、NAA濃度為0.2 mg·L-1時(shí)外植體形成大量愈傷組織，幾乎沒(méi)有叢生芽的形成。隨著6-BA和NAA濃度逐漸降低，叢生芽數(shù)量逐漸增加。6-BA濃度為1.0 mg·L-1、NAA濃度為0.1 mg·L-1時(shí)杭菊外植體形成大量叢生芽，且芽體健壯、深綠色，并有少量根毛長(zhǎng)出。

將增殖培養(yǎng)過(guò)程中形成的愈傷組織轉(zhuǎn)接到MS培養(yǎng)基(6-BA 1.0 mg·L-1，NAA 0.1 mg·L-1)上，如圖1中C所示，30 d后有大量叢生芽形成。

2.3 生根培養(yǎng)

將誘導(dǎo)產(chǎn)生的叢生芽轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基中，以MS為基本培養(yǎng)基并加入適量活性炭，6-BA 0.1 mg·L-1、NAA 0.1 mg·L-1、IBA 0.05 mg·L-1，培養(yǎng)4 d后，叢生芽出現(xiàn)白色根毛，15 d后植株長(zhǎng)勢(shì)旺盛，根系發(fā)達(dá)(圖2)。

3 小結(jié)

以杭菊莖尖為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，最佳滅菌方式為先用75%乙醇浸泡25 s，無(wú)菌水沖洗3次，再用0.1% HgCl2溶液滅菌7 min，無(wú)菌水沖洗5次，杭菊植株生長(zhǎng)狀況良好，成活率最高，污染率僅為18%。杭菊增殖過(guò)程中，MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1+蔗糖25 g·L-1+瓊脂8 g·L-1能分化出大量叢生芽；MS+6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1+蔗糖25 g·L-1+瓊脂8 g·L-1有大量愈傷組織形成。以MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1+IBA 0.05 mg·L-1+蔗糖25 g·L-1+瓊脂8 g·L-1為培養(yǎng)基，對(duì)杭菊叢生苗進(jìn)行生根培養(yǎng)，培養(yǎng)4 d杭菊叢生苗開(kāi)始出現(xiàn)根毛，植株長(zhǎng)勢(shì)明顯。

圖2 叢生芽接種到生根培養(yǎng)基中不同天數(shù)的生根情況

杭菊外植體被絨毛造成滅菌困難，在處理過(guò)程中也可加入適量洗衣粉或用毛刷輕輕刷去絨毛以便于進(jìn)行滅菌。同時(shí)，試驗(yàn)過(guò)程中分別在3月、4月、5月從田間選取杭菊植株進(jìn)行滅菌培養(yǎng)，隨著時(shí)間的推移，菊花在大田中生長(zhǎng)加快，取樣的外植體在培養(yǎng)過(guò)程中增殖和生根所需要的時(shí)間也逐漸縮短，這可能與外植體內(nèi)激素水平有一定聯(lián)系，需進(jìn)一步進(jìn)行研究。