流式細胞術免疫分型對多發性骨髓瘤的診斷價值

王星 張瑜 馬列婷

多發性骨髓瘤（Multiple myeloma，MM）是一種惡性漿細胞疾病，屬于B細胞淋巴瘤的一種，是骨髓漿細胞異常增殖性疾病。常常伴隨有高鈣血癥、貧血、多發性溶骨性、腎臟等損害?；颊呋疾『笳５拿庖咔虻鞍椎纳烧系K，較為容易發生感染。發病早期無特異性臨床癥狀，容易造成漏診和誤診。多發生于中老年患者，若得不到及時治療，嚴重威脅患者生命安全。臨床診斷MM的方法較多，有影像學檢查、臨床癥狀及實驗室檢查等[1]。伴隨著流式細胞術的不斷發展，以客觀、靈敏及快速的優勢，在MM診斷中有較高應用價值，在病情檢測、療效評價及預后判斷中有重要作用。本文通過收集我院56例MM患者，分析流式細胞術免疫分型對MM的診斷價值對比。

1 對象與方法

1.1 對象

抽取我院2016年1月—2018年12月收治的56例MM患者。納入標準：均符合《中國多發性骨髓瘤診治指南》中的標準[2]；簽署知情同意書，自愿參與此次研究，經我院醫學理論會同意。排除標準：嚴重心肝腎功能障礙基礎性疾??；其他血液系統疾?。痪癫　?/p>

男34例，女22例；年齡43～71歲，平均（58.78±5.34）歲；組織器官損害：7例血鈣增高，31例腎功損害，43例貧血，46例骨病變。DS分期：ⅠA 5例，ⅠB 7例，ⅡA 10例，ⅡB 17例，ⅢA 10例，ⅢB 7例。

1.2 研究方法

所有患者均給予骨髓細胞形態學檢查、流式細胞術檢查、毛細管免疫分型電泳、毛細管血清蛋白電泳。

（1）骨髓細胞形態學檢查：抽取0.2 mL脊髓液，涂片、晾干、染色、去染、晾干，于涂片、染色良好體尾交界處按照一定順序分類計數200個有核細胞，從而計算骨髓瘤細胞百分比。陽性標準：骨髓漿細胞超過10%。

（2）流式細胞術：采用Epics Eliet流式細胞儀，抽取2 mL肝素抗凝骨髓液，選擇5～10×106細胞/mL單細胞懸液，每100 μL單細胞懸液與20 μL好的抗體室溫避光孵育20分鐘，加入氯化銨溶血劑維持液體。按照1 500 rpm，離心10 min，去除上清，并采用0.5 mL PBS重懸后上機，PBS洗滌2遍、避光破膜15 min，加入胞漿抗體孵育30 min，洗滌1次后采用0.5 mL PBS重懸。采用BD FACSDiva軟件獲取、記錄及分析數據。每管分析10 000個細胞，將熒光強度軸設定為對數模式，并以CD45/SSC聯合CD38/CD138設門分析評估骨髓取材。用于多發性骨髓瘤細胞免疫分型的抗體有CD45，CD38，CD138，CD19，CD56，胞內Kappa輕鏈，胞內labda輕鏈。收集CD38＋＋／CD45-／＋細胞10 000個，利用同型對照設置Cut Off值，細胞群在某一抗原軸方向整體位移超出Cut Off線≥20%判定為該抗原表達陽性。

（3）毛細管免疫分型電泳：促凝全血標本3 000 r/min離心15分鐘分離血清，樣本同配套試劑一同放入全自動毛細管電泳儀上反應、電泳、掃描及判定結果。每個樣本進行6次血清蛋白電泳，其中一次為標準血清蛋白電泳，另外五次為加入抗IgM、IgA、IgG、k、γ抗體反應后的電泳。陽性標準：在標準血清蛋白電泳圖形中出現底部狹窄、高尖的異常蛋白峰，在加入抗IgM、IgA、IgG、k、γ抗體后的電泳圖形中，如出現異常蛋白峰的消失則為相應類型的克隆性Ig。

（4）毛細管血清蛋白電泳：用Sebia Capillarys全自動毛細管電泳儀及配套試劑，促凝全血標本3 000 r/min離心15分鐘分離血清，在全自動毛細管電泳儀上電泳分離、掃描及判定結果。陽性標準：掃描圖中α、β、γ區域底部狹窄，高尖的異常蛋白峰為陽性。

1.3 觀察指標

（1）記錄MM患者骨髓細胞形態學檢查、流式細胞術通過CD45/SSC聯合CD38/CD138設門分析檢測、毛細管免疫分型電泳、毛細管血清蛋白電泳檢測的陽性率；（2）記錄流式細胞術與骨髓細胞形態學檢測出的骨髓異常漿細胞的比例；（3）記錄流式細胞術對MM的分型結果及毛細管免疫分型電泳對MM的分型結果。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 比較各種檢查結果陽性率

（1）骨髓細胞形態學檢查：骨髓細胞形態學檢測陽性率為100%(56/56)，高于流式細胞術檢測陽性率96.43%（54/56），但差異無統計學意義（P＞0.05）（注：骨髓細胞形態學與流式細胞術對比：χ2=0.073，P=0.674）；高于毛細管免疫分型電泳檢測陽性率85.71%（48/56）及毛細管血清蛋白電泳檢測陽性率83.93%（47/56），差異具有統計學意義（P＜0.05）（注：骨髓細胞形態學與毛細管免疫分型電泳對比：χ2=5.653，P=0.015；骨髓細胞形態學與毛細管血清蛋白電泳對比：χ2=6.471，P=0.009）;（2）流式細胞術檢測：流式細胞術檢測陽性率為96.43%（54/56），陽性檢出率高于毛細管免疫分型電泳檢測陽性率85.71%（48/56）及毛細管血清蛋白電泳檢測陽性率83.93%（47/56），差異具有統計學意義（P＜0.05）（注：流式細胞術與毛細管免疫分型電泳對比：χ2=3.953，P=0.047；流式細胞術與毛細管血清蛋白電泳對比：χ2=4.940，P=0.026）；（3）毛細管免疫分型電泳與毛細管血清蛋白電泳檢查陽性率分別為85.71%（48/56）、83.93%（47/56），差異無統計學意義（P＞0.05）（注：毛細管免疫分型電泳與毛細管血清蛋白電泳對比：χ2=0.069，P=0.792）。

表1 流式細胞術及毛細管免疫分型電泳對MM 的免疫球蛋白kappa 型輕鏈分型結果比較

表2 流式細胞術及毛細管免疫分型電泳對MM 的免疫球蛋白Labda 型輕鏈分型結果比較

2.2 比較流式細胞術與骨髓細胞形態學檢出的異常漿細胞的比例

通過CD45/SSC聯合CD38/CD138設門分析，將CD45/SSC聯合CD38+/CD138+作為鑒別異常漿細胞的特異性指標，發現56例MM患者中54例在CD45/SSC散點圖可見異常細胞群，結合CD38/CD138鑒別為異常漿細胞，見圖1。通過流式細胞儀檢測到此54例陽性患者中的異常漿細胞比例為（33.59±8.41）%，低于同時期的骨髓細胞形態學檢查的骨髓漿細胞比例（43.25±10.82）%，二者做線性相關統計分析，結果pearson相關系數r=0.82，tr=10.528，P＜0.05，表明二者呈線性正相關。

2.3 比較流式細胞術及毛細管免疫分型電泳對MM的分型結果

流式細胞學檢查56例MM患者中有54例MM的免疫球蛋白呈陽性表達，其中胞內Kappa輕鏈單克隆21例（38.9%），胞內labda輕鏈單克隆33例（61.1%）。毛細管免疫分型電泳檢查56例MM患者中48例MM分泌免疫球蛋白，其中表達Kappa輕鏈型的18例（37.5%），表達Labda輕鏈型的30例（62.5%），有3例流式細胞術胞內Kappa輕鏈陽性而毛細管免疫分型電泳為陰性，差異無統計學意義（P＞0.05）（注：流式細胞術及毛細管免疫分型電泳對 MM的免疫球蛋白kappa型輕鏈分型結果比較：χ2=1.333，P=0.243），有3例流式細胞術胞內labda輕鏈陽性而毛細管免疫分型電泳為陰性，差異無統計學意義（P＞0.05）（注：流式細胞術及毛細管免疫分型電泳對MM的免疫球蛋白labda型輕鏈分型結果比較：χ2=1.333，P=0.243），具體見表1、表2。

3 討論

MM可以歸到B淋巴細胞淋巴瘤的范圍，其臨床表現較復雜，且缺乏特異性，早期診斷時極易誤診或漏診，耽誤最佳治療時機[3-4]。骨髓涂片細胞形態學具有直觀、經濟及操作簡單的特點，是最先用于MM患者診斷中[5]。MM細胞髓內浸潤、增值范圍不同，經過形態學檢查往往需要多次骨髓穿刺，有著較大差異性[6-7]。同時，在閱片選擇及細胞識別上，較強主觀性，與反應性漿細胞增多相鑒別，從而增加誤診。毛細管血清蛋白電泳、毛細管免疫分型電泳可有效檢測骨髓瘤細胞產生并釋放入血的M蛋白，有較小創傷性，且具有快捷性及經濟性[8-9]。流式細胞術免疫分型可快速準確客觀鑒別出漿液細胞的良惡性，可客觀及評估惡性漿液細胞，并且能夠揭示骨髓瘤細胞免疫表型的異質性及其胞內輕鏈的克隆性。以上特點是毛細管血清蛋白電泳和毛細管免疫分型電泳技術無法達到的[10]。

圖1 流式細胞術CD45/SSC 聯合CD38/CD138 設門分析

流式細胞術在多發性骨髓瘤中的應用涉及以下幾方面：通過檢測漿細胞免疫表型、克隆性，可明確漿細胞是否是良性、惡性，還是反應性的。流式細胞術可識別瘤細胞獨有的異常免疫常型，從復雜的骨髓細胞群中可圈出極其微量的瘤細胞；CD38、CD138為漿細胞特異性的表面標志物，CD45在正常漿細胞弱表達而在骨髓瘤細胞表達減低或不表達，CD19在正常漿細胞表達而在骨髓瘤細胞弱表達或不表達，CD56在正常漿細胞不表達而在骨髓瘤細胞中表達增高，且被認為是疾病預后不良的標志之一，cKappa輕鏈與clabda輕鏈在正常漿細胞呈多克隆表達，而在骨髓瘤細胞中為限制性表達[11]。同時可實現瘤細胞膜及胞內分子檢測，發現胞內輕鏈限制性表達，并不受到分泌與否及分泌多寡的影響。在本次研究中，通過流式細胞術對胞漿輕鏈限制性表達的一般特點給予抗體設置，其檢出率高于其他檢測方法。同時，本研究中有2例患者的流式細胞術結果為陰性，可能與多發性骨髓瘤的取材相關[3，12]。流式細胞術的應用較為成熟，應用于免疫分型具有較高的準確性。

綜上所述，流式細胞術免疫分型對MM的診斷有較高價值，可作為診斷MM的有效手段。