溫腎化痰方對ApoE 基因敲除小鼠動脈粥樣硬化易損斑塊模型Orai1、Caspase、Bax、Bcl-2 等基因及其相關蛋白表達的影響*

林海丹，陳銘泰，莊震坤，張 忠△，劉彩如

（1. 廣州中醫藥大學第四臨床醫學院，廣東 廣州510006；2. 廣州中醫藥大學深圳市中醫院心血管科，廣東 深圳518100；）

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是心血管意外的基本病理基礎。其形成發展與凋亡基因密切相關。大量研究表明，控制動脈粥樣硬化甚至逆轉其發展趨勢，可以減少急性心腦血管事件意外發生。AS 主要為血管內膜發生脂質等物質沉積，中層血管平滑肌增殖遷移，導致內膜增厚，從而形成粥樣病變[1-2]。Orai1、Caspase、Bax、Bcl-2 等基因在該病理過程中起關鍵作用。本實驗通過檢測不同分組的ApoE 基因敲除小鼠動脈粥樣硬化模型的Orai1、Caspase、Bax、Bcl-2 基因及其對應的蛋白，從動物實驗方面進行基因及蛋白研究，為溫腎化痰方調節動脈粥樣硬化提供基因及蛋白層面的實驗依據。

1 資料與方法

1.1 實驗動物、飼料與藥物 6 周齡ApoE-/-小鼠，均為雄性，體質量20～30g，SPF（Specific pathogen Free，SPF）級，實驗前普通飼料喂養1 周。高脂、高膽固醇飼料含1%膽固醇及5%豬油。溫腎化痰方：仙茅10 g，仙靈脾10 g，石菖蒲15 g，瓜蔞皮15 g，乳香15 g 加工制成含生藥0.5265 g/mL 中藥濃縮液，由廣州中醫藥大學附屬第一醫院中藥房提供。陽性對照藥為阿托伐他汀鈣片（20 mg/片，輝瑞制藥有限公司）。

1.2 動物分組與給藥 將ApoE-/-小鼠120 只按體重分層隨機法，平均分為6 組，分別為空白對照組、易損斑塊組、陽性對照組、低、中、高劑量中藥組。普通飼料喂養空白對照組12 周。高脂、高膽固醇飼料喂養剩余5 組小組8 周后繼而予高脂飼料喂養4周。空白對照組及易損斑塊組小鼠均不給藥，予生理鹽水1 mL/d 灌胃，陽性對照組予阿托伐他汀鈣喂養5 mg/kg·d-1，低、中、高劑量中藥組分別予溫腎化痰方5.256 g/kg·d-1、10.053 g/kg·d-1、20.106 g/kg·d-1喂養，以上藥液均在8 周后開始灌胃給藥4 周。

1.3 Western blot 法檢測蛋白表達 配制Tris-甘氨酸SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離膠及濃縮膠后，稱取組織后裂解離心，取上清液，用BCA 蛋白定量檢測試劑盒進行組織蛋白定量，將定量裂解后的樣品取100 μL 加入5X 蛋白上樣緩沖液25 μL 混勻。電磁爐煮沸處理15 min，冷卻后待用。

Western blot 法檢測蛋白表達：將樣品滴加到凝膠孔內電泳；轉膜；取膜放置脫脂奶粉（濃度5%）封閉孵育；結束后PBST 洗膜；再加入用PBS 含1%的BSA 為稀釋液的一抗搖床振蕩孵育1 h；孵育結束后PBST 洗膜；加入HRP 標記的二抗振蕩孵育1 h；孵育結束后PBST 洗膜；ECL 發光顯影，定影。使用ImageJ軟件分析條帶灰度值并進行統計分析。

1.4 RT-PCR 檢測mRNA 表達 樣品研磨成粉后于離心管中反復振蕩裂解，加入Trizol 吹打裂解；加入氯仿劇烈震蕩1 min 后靜置5 min 后12 000r 離心10 min；取上清液移至異丙醇EP 管中混勻離心10 min；去上清，加入乙醇離心5 min，去上清；干燥后DEPC 溶解；與DNaseⅠ等配置反應液；加苯酚后離心；再取上清液加氯仿后離心；再取上清液后加異丙醇靜置、離心、去上清；乙醇洗滌、風干；加DEPC 溶解；在PCR 管中加入RNA、引物混合物70℃保溫10 min 后迅速在冰上冷卻2 min；加入RNA/引物變性溶液等試劑后42 ℃保溫60 min、72℃保溫15 min、-20℃保存備用；cDNA 稀釋10 倍；加入引物、ddH2O 等配制反應體系；使用PRIMER5 軟件/NCBI 在線設計引物；使用ViiA7 software 設定反應條件并分析基因擴增曲線和溶解曲線。

1.5 統計學方法 采用SPSS 20.0 統計軟件統計分析，數據用均數±標準差（s）表示。多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩組之間的比較采用t 檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

圖1 各蛋白條帶灰度情況

表1 各蛋白相對灰度值

2.1 用藥前后各組蛋白表達情況 給藥4 周后，各組條帶灰度情況如下（見圖1 及表1）。各組小鼠內參蛋白條帶基本一致，即各組小鼠樣品上樣量基本一致。與空白對照組相比，易損斑塊組的Orail1、Caspase3、Caspase9、Bax 蛋白表達上調，BCI-2 蛋白表達則下調明顯，表明易損斑塊組的促進凋亡的相關蛋白增加，抑制凋亡的BCI-2 蛋白減少。與易損斑塊組相比，余5組的Orail1、Caspase3、Caspase9、Bax 蛋白表達下調，且中藥劑量越大，下調程度越明顯，表明溫腎化痰方能下調促凋亡的相關蛋白的表達；同時余5 組的BCI-2 蛋白表達上調，且上調程度隨中藥劑量增加而增加，即表明溫腎化痰方能上調抑制凋亡的BCI-2 蛋白表達。與陽性對照組相比，溫腎化痰方各劑量組下調促凋亡的相關蛋白及上調抑制凋亡的相關蛋白的作用一致。且其作用隨中藥劑量的增加而增強。高劑量中藥組作用與陽性對照組條帶基本一致，說明高劑量溫腎化痰方的作用與阿托伐他汀鈣作用基本一致。

2.2 各組大體標本情況

圖2 各組大體標本情況

2.3 用藥前后各組mRNA 表達情況 給藥4 周后，各組基因相對樣品模板量見表2。

表2 各組基因相對樣品模板量結果比較

表2 各組基因相對樣品模板量結果比較

各組基因相對樣品模板量2-△△CT相比結果顯示：易損斑塊組的Orail、Caspase3、Caspase9、Bax 含量均比空白對照組明顯上升，而Bcl2 含量比空白對照組明顯下降，統計有顯著性差異（P＜0.01）。陽性對照組的Orail、Caspase3、Caspase9、Bax、及Bcl2 含量與空白對照組相比基本一致，統計無顯著性差異（P>0.05）。各中藥組的Orail、Caspase3、Caspase9、Bax 含量與易損斑塊組相比，隨中藥劑量增加而下降，而Bcl2 含量則隨中藥劑量增加而增加。其中高劑量中藥組與陽性對照組及空白對照組相比，其各組基因含量無顯著性差異（P＞0.05）。

3 討論

動脈粥樣硬化是一種慢性退行性改變，由脂質等物質沉積管壁，引起細胞吞噬并泡沫化，進而血管平滑肌細胞增殖遷移，從而導致管壁硬化、管腔變細等病理性改變[1-2]。Orail 是質膜上的控制Ca2+流通的跨膜蛋白，在血管平滑肌細胞、上皮細胞等多種細胞中表達[3-4]。其在被激活狀態下構建鈣釋放激活鈣通道，從而調節Ca2+進入細胞，調控細胞分化、凋亡[5-7]。研究表明，Orail 與動脈斑塊硬化發生發展起促進作用[8]。Bax 屬Bcl-2 家族成員，在細胞凋亡中也起到促進作用，尤其促進不穩定型粥樣斑塊的增生[9-10]。Bax 促進平滑肌細胞發生凋亡，釋放炎性因子，加重炎性反應，同時細胞碎片促進血栓形成，影響斑塊穩定[10-11]。而Bcl-2 是細胞凋亡的關鍵調控原癌基因，主要參與調節心肌細胞凋亡過程，作用與Bax 相反，即主要阻止Caspase9 及后續的Caspase3 的一系列活化，從而促進細胞生存，逆轉細胞凋亡的發生[12-15]。Caspase3、Caspase9 均屬Caspase 家族中促凋亡的基因及相對應的酶。Caspase 家族屬半胱氨酸天門冬氨酸蛋白水解酶，在細胞凋亡中是多條凋亡機制通路的核心匯聚點，其中Caspase9 起啟動作用，而Caspase3 起效應作用，且Caspase3 活性最高，特異性徹底裂解底物使細胞最終凋亡[16-18]。

大量研究表明，ApoE（載脂蛋白E）的基因多態性與血脂異常、動脈粥樣硬化有密切的相關性[19-21]。為排除ApoE 基因干擾，本實驗選用ApoE 基因敲除小鼠為實驗對象，建立動脈粥樣硬化易損斑塊模型，觀察溫腎化痰方對小鼠相關促進或抑制斑塊形成的基因及其蛋白的影響。溫腎化痰方由廣東省名中醫羅陸一教授根據經典名方二仙湯結合個人經驗及科研成果加減化裁而來，由仙靈脾、仙茅、石菖蒲、瓜蔞皮、乳香等藥味組成。其中仙靈脾辛溫，歸肝腎經，補腎強骨；仙茅辛溫，入腎，溫腎壯陽；石菖蒲辛苦溫，歸心胃經，化濕豁痰，活血理氣；瓜蔞皮甘寒，歸肺胃經，化痰利氣寬胸；乳香辛苦溫，活血止痛。全方有活血化瘀、溫腎助陽的功效。課題組認為本病為年老腎陽衰微，痰瘀阻滯，故發本病，當以溫腎化痰為法，故以此方為實驗治療方。

通過實驗可知，與易損斑塊組相比，溫腎化痰方可明顯下調Orail、Caspase3、Caspase9、Bax 的基因及蛋白表達。表明溫腎化痰方可通過降低促凋亡基因的表達及相應蛋白的激活及表達，從而降低細胞凋亡及增殖的幾率，延緩甚至改善動脈粥樣硬化斑塊的進展。同時溫腎化痰方可上調Bcl-2 的基因及蛋白表達。表明溫腎化痰方可增加抑制細胞凋亡的基因表達，截斷Caspase 級聯反應，從而減少平滑肌細胞的凋亡及增殖，正向抑制動脈粥樣硬化的發生發展。高劑量中藥組與陽性對照組相比，統計學無顯著性差異，表明高劑量溫腎化痰方調節相關基因及蛋白的作用與阿托伐他汀鈣一致，但要注意劑量問題。從這方面又可表明中醫藥的療效與劑量有密切關系。溫腎化痰方如何調節相關基因的表達，通過何種或多種組分如何進行藥理反應，實驗中尚未可知，具體藥理機制需待進一步研究。

綜上所述：溫腎化痰方可通過調節與血管平滑肌細胞的凋亡、增殖相關的基因及蛋白表達，從基因層面降低血管平滑肌細胞的凋亡率，改善動脈粥樣硬化斑塊形成及發展，從而起到保護心血管的作用。