五谷麒麟膏調控Bcl-xl/Bak 促進肛瘺術后創面愈合機制研究*

苗 咪，馮文哲，陰新元，柴小琴，朱建東

（1. 陜西中醫藥大學，陜西 咸陽712000；2. 陜西中醫藥大學附屬醫院，陜西 咸陽712000）

肛瘺，中醫稱之為“肛漏”，是指肛管、直腸與肛門周圍皮膚之間所形成的異常通道，目前關于其發病機制說法較多，但大眾較為認可的學說是由于肛竇感染引起，其為肛癰未及時處理或處理不當所致[1]。肛瘺自愈較為困難，為臨床極其常見、多發的肛腸疾病，尤其以男性居多[2]。古代醫家認為漏病的病因有三：一是由痔形成，二是漏病多由癰潰后形成，三是久咳引起[3]。明代《永類鈴方》首創掛線療法治療肛瘺，說明自古以來手術就是肛瘺的主要治療方法。肛瘺發病多因濕熱邪毒而引起，濕與熱滯留于術后創面，阻礙氣血運行，而導致創面難以愈合，此乃肛瘺創面不易愈合的病因病機[2]。因而尋求一種能夠有效的促進術后創面愈合的方法顯得尤為重要。肛瘺術后外治法主要是基于化腐生肌理論的治療。如果傷口分泌物較少，肉芽生長緩慢，則主要以“煨膿長肉”法為主。煨膿長肉法是中醫外科的特色療法，目前在臨床上常用來治療一些慢性難愈性創面[4]。本課題將“煨膿長肉”理論作用下擬定的五谷麒麟膏應用于促進SD 大鼠肛瘺創面模型愈合的實驗研究，擴大了“煨膿長肉”法的運用范圍，我們以細胞凋亡為切入點，通過Bcl-xl、Bak蛋白表達水平，從分子水平論述五谷麒麟膏促進創面愈合的機理。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及分組 120 只雄性SPF 級SD 大鼠，體質量20～150 g，由西安交通大學醫學部實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK（陜）2017-003。飼養于陜西中醫藥大學醫學實驗動物中心。飼養溫度：20～25 ℃，相對濕度：40%～60%。實驗期間，動物可以自由飲水并喂養普通飼料（西安交通大學醫學部實驗動物中心提供）。按完全隨機法隨機分為6 組：模型組20 只、京萬紅陽性對照組20 只、五谷麒麟膏高、中、低藥物濃度組20 只，另設20 只為正常對照組。適應性喂養2 周，待體質量達80～200g 左右后開始實驗。

1.1.2 藥物與制劑 五谷麒麟膏組分為：五谷蟲30 g、血竭（又名血麒麟）30 g、紫草15 g、蛋黃油、麻油等。制備所需中藥均來自陜西中醫藥大學附屬醫院中藥房。制作方法先將五谷蟲粉、紫草倆兩味入混合油內浸3d，然后文火熬枯去渣。再入血竭化盡，次入白蠟微火化開，待油溫后，再入研細輕粉攪勻，冷卻后即凝成膏。五谷麒麟膏含藥劑量分組：五谷麒麟膏低濃度組：10%濃度；五谷麒麟膏中濃度組：20%濃度；五谷麒麟膏高濃度組：40%濃度。京萬紅軟膏采用由天津達仁堂二藥業有限公司生產。凡士林采用商丘市偉康醫用品廠生產的白凡士林，每瓶400 g。

1.1.3 試劑與實驗儀器 Bcl-xl 試劑盒（貨號2764 s，購自CST）；Bak 試劑盒（貨號bs-1284R，購自Bioss）；蘇木素試劑盒（貨號H9627，購自Sigma）；伊紅Y（水溶性）試劑盒（貨號71014544，購自國藥集團）；脫水機（武漢俊杰JT-12J 電腦生物組織脫水機）；蠟塊包埋機；病理切片機（德國Leica RM 2016輪轉式切片機）；切片刀（日本羽毛R35 一次性刀片）；組織攤烤片機（武漢俊杰JK-6 生物組織攤烤片機）；載玻片及蓋玻片（江蘇世泰實驗器材有限公司）；顯微鏡（奧林巴斯BX53 型生物顯微鏡）；抗原修復用電陶爐（SKG）。

1.2 方法

1.2.1 模型制備 采用付小兵等方法制造污染性傷口愈合的動物模型，制造模擬肛瘺術后創面的動物模型[5-6]。將實驗組、京萬紅組、模型組大鼠背部手術區域備皮，并用5%水合氯醛溶液（0.007 mL/g）腹腔注射麻醉，碘伏棉球常規消毒，剪去邊長為3.0 cm 大小方形皮膚，破壞皮膚全層及皮下淺筋膜直至肌層，止血后將大鼠糞便混懸液淋灑在傷口表面。創面部位敷以創面相應大小的油紗敷料，用紗布包扎以止血，24 h 后去除覆蓋物。每日傷口淋灑糞便混懸液，72 h 后見傷口有膿性分泌物，滲液較多，創緣皮色發紅，即造模成功。此時創面為一個“急性、開放、滲血、感染”創面，類似于臨床肛瘺術后的創面。

1.2.2 給藥方法 制作傷口模型成功后，模型組大鼠的創面外敷凡士林0.2 g；陽性藥物京萬紅組外敷京萬紅0.2 g；治療組五谷麒麟膏高、中、低濃度各組分別外敷五谷麒麟膏高、中、低濃度藥膏，每個創面0.2 g，分組喂養。每日下午定時換藥1 次，正常對照組常規飼養，未做任何治療。

1.2.3 取材 用藥后3 d、7 d、11 d、15 d，用透明薄

膜緊密敷貼于創口上，用較細記號筆畫出傷口的邊緣，然后將透明薄膜平鋪在ECG 紙上，計算出創面面積數值（cm2）[7]。在無菌條件下取創面中心至創緣正常皮膚間的新生肉芽組織，洗去表面血液然后固定于10%中性福爾馬林溶液。后經過脫水、透明、石蠟包埋制成蠟塊，并連續4 um 切片以備后期使用。

1.2.4 檢測指標和方法 一般情況：每次換藥時，通過目視檢查記錄大鼠生命體征和傷口，包括大鼠的喂養和活動情況，傷口的顏色和質地，及滲液、周圍組織水腫、痂皮等情況[8]。

創面愈合率：第n 天傷口愈合百分比（%）=（原始傷口面積-第n 天傷口面積）/原始傷口面積×100%[9]。在術后第3、7、11、15 天測量并記錄傷口面積大小，并計算傷口愈合百分比。其中術后第1 天的傷口面積為原始傷口面積。

創面組織學觀察：將切好的蠟片常規HE 染色后光學顯微鏡觀察新生毛細血管數。

免疫組化檢測Bcl-xl/Bak 比值：采用免疫組化SAP（堿性磷酸酶法）方法進行免疫組化染色。光學顯微鏡下拍照后用Image-Pro Plus 6.0 圖像分析軟件半定量分析Bcl-xl 及Bak 的值，然后計算Bcl-xl/Bak比值。

細胞凋亡率：采用TUNEL 法進行染色。光學顯微鏡下拍照后用Image-Pro Plus 6.0 圖像分析軟件定量分析細胞凋亡數及細胞總數。第n 天細胞凋亡率（%）=細胞凋亡數/總細胞數×100%。

1.3 統計學方法 實驗數據用SPSS24.0 統計分析軟件處理。所有實驗數據均為計數資料。計數資料數據采用均數±標準差）表示多組間樣本均數比較用方差分析，兩兩比較用配對t 檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠一般情況比較 造模后當天各組大鼠進食較少，此后各組大鼠進食均有所增加，3-10 d 京萬紅組及實驗組各大鼠的進食及活動情況均優于模型組；3-7 d 實驗組各大鼠創面肉芽新鮮紅活，局部滲液較多，京萬紅組大鼠創面顏色淡紅，傷口滲液較多，模型組大鼠創面顏色淡白，局部滲液較少；7-15 d各組大鼠創面開始結痂，分泌物逐漸減少，其中實驗組大鼠傷口痂皮較厚，范圍較大，京萬紅組次之，模型組較差。正常組無陽性癥狀。

2.2 各組大鼠不同時期創面愈合率比較 創面愈合率可直接反映大鼠傷口愈合程度，進而反映不同藥膏對大鼠創面愈合的影響。實驗結果表明，實驗組及京萬紅組大鼠創面愈合率均優于模型組，且高濃度組愈合率優于中濃度組，中濃度組優于京萬紅組與低濃度組，差異有統計學意義（P＜0.05），京萬紅組與低濃組間無明顯差異，差異無統計學意義。見表1。

表1 各組大鼠不同時期創面愈合率比較（

表1 各組大鼠不同時期創面愈合率比較（

注：與模型組相比，aP＜0.05；與京萬紅組相比，bP＜0.05；與低濃度組相比，cP＜0.05；與中濃度組相比，dP＜0.05

2.3 創面組織學觀察在傷口愈合過程中，肉芽組織形成和傷口收縮是創面愈合的重要環節。肉芽組織主要由毛細血管、炎癥細胞、成纖維細胞和肌成纖維細胞所組成[8]。組織切片后常規HE 染色，通過觀察400 倍鏡下新生毛細血管數量可判斷創面肉芽組織生長情況，間接反映不同藥物促進創面愈合的程度。見圖1。

圖1 用藥后11d 各組大鼠創面新生毛細血管數量

2.4 Bcl-xl/Bak 比值 模型組大鼠創面肉芽組織中Bcl-xl 及Bak 蛋白表達均低于陽性對照組及實驗組，且Bcl-xl/Bak 比值最高差異有統計學意義（P＜0.05）；高濃度組Bcl-xl 及Bak 蛋白表達最高，Bcl-xl/Bak 比值最低，中濃度組次之，低濃度組高于中濃度組，差異有統計學意義（P＜0.05）。低濃度組與京萬紅組無明顯差異，差異無統計學意義（P>0.05）。見表2、圖2。

表2 各組大鼠不同時期創面肉芽組織中Bcl-xl/Bak 比值

注：與模型組相比，aP＜0.05；與京萬紅組相比，bP＜0.05；與低濃度組相比，cP＜0.05；與中濃度組相比，dP＜0.05

圖2 用藥后11d 大鼠創面Bcl-xl 及Bak 表達情況

2.5 細胞凋亡率 用藥后第3 d 各組大鼠創面細胞凋亡率無明顯差異；第7、11 d 細胞凋亡率明顯增加，其中第11 d 凋亡率達到最大，且實驗組均高于模型組；第15 d 各組細胞凋亡率降低，且實驗組凋亡率低于模型組，差異有統計學意義（P＜0.05）。低濃度組與京萬紅組無明顯差異。見表3、圖3。

表3 各組大鼠不同時期細胞凋亡率比較，%）

表3 各組大鼠不同時期細胞凋亡率比較，%）

注：與模型組相比，aP＜0.05；與京萬紅組相比，bP＜0.05；與低濃度組相比，cP＜0.05；與中濃度組相比，dP＜0.05

圖3 用藥后11 d 大鼠創面Bcl-xl 及Bak 表達情況

3 討論

肛瘺是肛管直腸與肛門周圍皮膚之間的異常通道，也稱為肛管直腸瘺[10]。由于其特殊的病變部位和病理改變，肛瘺多需手術治療。肛瘺術后創面一般為開放性傷口，易受糞便污染，因此傷口愈合緩慢是臨床中較為棘手的問題[9]。中醫藥在創面愈合方面有著獨特的優勢，尤其對創傷后期的愈合起著十分顯著的作用[11]。因此，開發能加速創面修復及縮短愈合時間的藥物具有重要的臨床及社會價值。

中醫藥在促進傷口愈合方面有著悠久的歷史。早在戰國時期的《周禮·天官》就已有記載：“瘍醫掌腫瘍、潰瘍、金瘍、折瘍”，說明此時的瘍醫已經掌握了治療瘡瘍的方法，如理氣、活血、解毒、利濕中藥內服，結合去腐生肌等中藥外用。關于“煨膿長肉”的討論，首次出現在申斗垣《外科啟玄·明瘡瘍宜貼膏藥論》中：“在凡瘡毒已平，膿水來少，開爛已定，…至此強壯諸瘡，豈能致于敗壞乎？”[12]。五谷麒麟膏是我們在前期“煨膿長肉”法理論研究的基礎上，經過查閱大量的相關文獻以及結合我們的臨床經驗所研制的外用油膏[13]。主要成分有：五谷蟲、血竭、紫草等。五谷蟲，味咸，性寒，歸脾、肺經，現代藥理研究認為五谷蟲具有抑菌、抗炎、促進創面愈合等作用，臨床可用于創面愈合，關節炎等[14-15]。血竭，又名血麒麟，味甘、咸，性平，歸心、肝經，現代醫藥研究發現血竭主要含有黃烷類、三萜類等成分，包括：血竭紅素和血竭素等，它具有止血、鎮痛、促進組織愈合等藥理作用[16]。紫草，味甘、咸，性寒，歸心、肝經。紫草中含有萘醌類，單萜苯酚及苯醌類等多種化學成分，其藥理作用主要體現在促進傷口愈合、抗流感病毒、抗腫瘤、抗癌等方面[17]。

創面愈合是人體內一系列正常的病理生理過程，是指組織因創傷或其他原因而受損或離斷，局部組織通過再生、重建得到修復[18]。該過程由主要有炎癥細胞、修復細胞、細胞外基質以及多種細胞因子共同參與并互相調控而完成[19]。細胞增殖在創面愈合過程中的作用已被研究得深入且透徹。目前，細胞凋亡在創面愈合方面是研究的熱點話題。細胞凋亡是生命的基本現象，是為維持內環境穩定，由基因控制的細胞自主的有序死亡。細胞凋亡是多基因參與、控制的過程，包括Bcl-2 家族、Caspase 家族、癌基因C-myc、抑癌基因P53 等，這些基因在種屬之間非常保守。其中凋亡相關蛋白中的Bcl-2 家族是細胞凋亡的關鍵調節因子，其抗凋亡和促凋亡成員協同作用，發揮著細胞凋亡“開關”的作用。在眾多凋亡途徑中，線粒體途徑是主要的內在途徑，在此途徑中Bcl-2 家族起著相當重要的作用。Bcl-2 家族分2 類，其中凋亡抑制基因有Bcl-2，Bcl-xl，Bcl-W 等，凋亡促進基因有Bax、Bak、Bcl-Xs、Bax、Bik/Nbk、Bid 等[20]。Bcl-xl/Bak 的比值決定組織受到創傷后組織修復的快慢。此值越小則細胞趨于存活，創面愈合越快；值越大則細胞趨于凋亡，創傷修復較慢[21]。本實驗創面肉芽組織中Bcl-xl/Bak>1，且高濃度組的比值最低，中濃度組次之，低濃度組高于中濃度組，低濃度組與京萬紅組無明顯差異，說明高濃度組創面愈合最快，模型組最慢，故該藥膏可加速創面的愈合，且以高濃度組最優。

本次研究結果表明，實驗組大鼠創面中Bcl-xl及Bak 的表達均高于模型組，且Bcl-xl/Bak 比值優于模型組。由此表明五谷麒麟膏能通過調控創面肉芽組織中Bcl-xl/Bak 的表達，抑制創面肉芽組織細胞的過度凋亡，加速各創傷細胞的修復，進而對創面愈合發揮治療作用。該油膏具有緩解止痛、止血、促進傷口愈合的良好效果。可以將五谷麒麟膏用于臨床肛瘺術后創面促愈，并且有較好的推廣應用前景。