推拿對膝骨性關節炎大鼠滑膜TRAF6、NF-κBp65 mRNA 及蛋白的影響*

曲崇正，劉 姣，陶 靜，江鋼輝

（1. 廣州中醫藥大學第三附屬醫院，廣東 廣州510360；2. 廣州中醫藥大學，廣東 廣州510405）

膝關節骨性關節炎（knee osteoarthritis，KOA）是一種常見的慢性退行性疾病，主要病變特征為關節軟骨損壞、關節囊退變及滑膜炎癥反應，早期主要表現為關節腫痛，發展至中晚期可出現關節畸形、活動障礙等[1-5]。目前的臨床研究證明，推拿可以有效防治膝骨性關節炎[6-7]，但其機制不夠明確。近來研究發現，膝骨性關節炎的病變除了與軟骨的退變相關外，滑膜也占據主導地位[8-9]。TLR4/NF－κBp65 信號轉導通路是近年來膝骨性關節炎方面研究較多的炎癥通路，而NF-ΚBp65、TRAF6 是這條通路中的2 個關鍵致炎因子[10]。本實驗通過觀察膝骨性關節炎大鼠滑膜TRAF6、NF-ΚBp65 mRNA 及蛋白的表達，探討推拿治療膝骨性關節炎的機制。

1 材料和方法

1.1 設計 隨機對照動物體內實驗

1.2 時間及地點 實驗于2018 年3 月22 日至2018年5 月19 日在廣州中藥大學動物實驗中心完成。

1.3 材料

1.3.1 實驗動物 3 月齡健康SPF 級SD 雌性大鼠50 只，體質量180～220 g，由山東省實驗動物中心提供，動物生產許可證號SCXK（魯）20140007。所有實驗大鼠均在SPF 級實驗室中飼養，不限飲食，自由進食飼料和水。

單位在用該方法來展開分析時，其需要把成本看成是產量的函數，然后再從此角度來展開研究，當得出結論之后，其需要與原始的成本與當前的結果進行成本區分，即主要分為兩大類型。需要注意的是，聯系成本與產品自身的動態分析，其是構成管理會計的重要部分。

1.3.2 實驗用主要試劑 熒光定量PCR 檢測試劑盒（AOPR-1200，Genecopies）；TRIzol Reagent（DP424，天根）；逆轉錄試劑盒（DBI-2220，DBI）；DEPC（V900882，Vetec）；木瓜蛋白酶（上海源葉生物科技有限公司S10011，CAS：9001-73-4）；塞來昔布（輝瑞制藥有限公司，國藥準字J20140072）；Anti-NF-kB p65 antibody（Abcam，8242T）；RP-Goat Anti-Mouse IgG（Jackson，115-035-003）。

4 周推拿、灌胃給藥治療結束后處死所有大鼠，取出膝關節滑膜用于熒光定量PCR、Western blot 檢測。

2.3 各組滑膜TRAF6、NF-ΚBp65 mRNA 的表達水平

1.4 方法

1.4.1 分組與造模 采用隨機化的原則，抽取10 只大鼠為空白組，余下40 只大鼠采用木瓜蛋白酶法[11-12]制作大鼠膝骨性關節炎模型，待造模成功后，再將造模大鼠隨機分為模型組、推拿組、灌胃組、推拿加灌胃組，每組10 只。

1.5 主要觀察指標 實時熒光定量PCR 檢測各組大鼠滑膜TRAF6、NF-ΚBp65 mRNA 表達水平；Western blot 檢測TRAF6、NF-ΚBp65 蛋白表達水平。

2.2 滑膜形態觀察 經肉眼觀察，空白組大鼠滑膜平滑光亮，呈粉紅色，薄而柔潤。模型組大鼠滑膜顏色較深，組織水腫、變厚。推拿組、推拿加灌胃組大鼠滑膜組織顏色較正常稍變深，灌胃大鼠滑膜顏色呈紅色。

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1.3.3 實驗設備 熒光定量PCR 儀（7500，ABI）；基因擴增儀（9600，珠海黑馬）；多功能酶標儀（上?，F科儀器有限公司）；掃描儀（Canon）；暗匣（廣東粵華醫療器械廠有限公司）；感光膠片（kodak）；電泳儀（北京六一儀器廠）；臺式高速離心機（D3204R，SCIlogex）；微量核酸定量儀（SMA4000，Merinton）；灰度分析軟件（Image J）。

1.4.3 熒光定量PCR 檢測TRAF6、NF-ΚBp65 mRNA 表達 運用Trizol 法對大鼠膝關節滑膜進行總RNA 提取，然后進行逆轉錄操作，嚴格按照試劑盒說明書進行，熒光定量PCR 檢測TRAF6、NF-ΚBp65 mRNA 表達水平。本實驗采用GAPDH 作為內參，引物序列見表1。

圖6設振元個數為n個，從左到右依次排列，tn為陣元n延時時間，θ為聲束偏轉角，d為陣元中心距，c為超聲聲速，可得相控陣超聲聲束偏轉的延時法則為:

表1 引物序列

職業教育是以培養高素質的技能型人才為目標的，因此在教學過程中要著力培養學生的動手能力、綜合職業素質和創新能力。職業教育的教學方法同傳統的教學方法相比也有很大的不同。職業教育面對的對象大都是初中、高中畢業生，自控能力不強、基礎差，在學習中不會很主動、很積極地學習各種專業知識，導致教與學的效果都不是很好。鐵道工程機械系統故障排除課程實踐性強，能引起學生的興趣，培養學生的實踐精神與創新能力。教學方法直接影響教學效果，而“任務驅動情景教學法”可以達到比較理想的教學效果。

造模方法：使用10%水合氯醛生理鹽水溶液腹腔麻醉大鼠后，將大鼠雙膝關節絨毛剃凈，消毒皮膚表面，屈曲大鼠膝骨關節以便于觸到外膝眼所在，確定進針點后，沿髁間窩方向進針，針頭刺入皮膚表面后會有落空感，然后將木瓜蛋白酶推入，雙側膝關節腔分別注射4%木瓜蛋白酶0.2 mL。出針后按壓針口約1 分鐘，用酒精擦凈血跡，最后將大鼠放回籠內常規飼養。于實驗開始的第1、4、7 天重復操作。關節注射3 次后，使用動物實驗跑臺驅趕大鼠跑步1 周，每天20 min。

1.4.4 Western blot 檢測TRAF6、NF-ΚBp65 蛋白表達將凍存與-80℃冰箱的滑膜組織取出備用，使用RIPA 裂解液將細胞裂解，按說明書步驟配制總蛋白溶液，再將滑膜組織勻漿。BCA 法測定蛋白質濃度。測完蛋白含量后，按照5 ∶1 的比例加入蛋白上樣緩沖液，滾水煮約5 min。將樣本配制于分離膠及濃縮膠中進行電泳，然后轉移至PVDF 膜，室溫下將膜脫色后，使用5%的脫脂牛奶封閉一小時，加入配制的稀釋一抗（TBST 溶解的5%脫脂牛奶，磷酸化蛋白使用TBST 溶解的5%BSA），4℃過夜。洗膜后，再次加入稀釋一抗室溫下孵育30 min 后洗膜。用化學發光劑顯影，獲取圖像，Image J 軟件處理系統分析TRAF6、NF-ΚBp65 蛋白表達水平。以GAPDH 作內參對照，每個蛋白重復檢測3 次。

2 結果

2.1 實驗動物數量分析 實驗過程中無大鼠死亡，除為驗證造模是否成功每組處死1 只大鼠外，余下大鼠每組9 只均完成所有干預治療，進入結果分析。

1.4.2 干預方法 造模完成后的第1 天，進行推拿、灌胃給藥治療。推拿組將大鼠固定于大鼠固定器上，遵循《實驗針灸學》[13]的取穴原則確定穴位所在，待大鼠平靜后，于大鼠膝關節的內膝眼、外膝眼、血海、梁丘等穴行一指禪推法，以拇指前端精準接觸穴位，頻率控制約120 次/min，每穴推約2 min，最后屈伸膝關節10 次，結束治療，每次總治療時間約10 min，每天1 次。參照《藥理實驗方法學》[14]種屬間等效劑量折算表，灌胃組予以塞來昔布24 mg/kg·d 灌胃，藥物劑量：每天塞來昔布24 mg/kg 溶于生理鹽水中配制成混懸液，定時給藥，每天1 次。推拿加灌胃組予以上2種干預方式，每天1 次。

1.3.4 溶液配制 磷酸化蛋白酶抑制劑：每1 mL RIPA 試劑配制100 mM PMSF 10 μL，加蛋白酶抑制劑5 μL，加磷酸化蛋白酶抑制劑5 μL，混勻；30%丙烯酰胺（1 L）：BIS 10 g 配丙烯酰胺290 g，加入去離子水直至1 000 mL；TBS 緩沖液（1 L）：10 mL Na-Cl 8.8 g 配1 M Tris-HCl（pH=7.5），加入去離子水直到1 000 mL；轉移緩沖液（2L）：甲醇400 mL 配甘氨酸28.8 g 配Tris 4.84 g 加入去離子水直到2 000 mL；非磷酸化蛋白酶抑制劑：每1 mL RIPA 試劑配制100 mM PMSF 10 μL、蛋白酶抑制劑5 μL，混勻；電泳緩沖液（2L）：2 g SDS 配37.54 g 甘氨酸配6.06 g Tris 加入去離子水直到2 000 mL。

2.3.1 TRAF6 mRNA 表達水平 與空白組相比，模型組、推拿組、灌胃組的TRAF6 mRNA 表達均上調，差異具有統計學意義（P＜0.05），推拿加灌胃組與空白組相比TRAF6 mRNA 表達幾乎無差異，稍上調（P>0.05）；與模型組相比，各治療組TRAF6 mRNA 表達下調，差異具有統計學意義（P＜0.05），且各治療組TRAF6 mRNA 表達量：推拿加灌胃組＜推拿組＜灌胃組，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見表2、圖1。

貴州9個地區土壤對Cd的吸附△Go<0，說明吸附反應可自發進行。在相同pH條件下，土壤對重金屬的吸附量與初始濃度呈正相關；在不同pH條件下，土壤對重金屬Cd的吸附量隨pH升高而逐漸增大。

2.3.2 NF-ΚBp65 mRNA 表達水平 與空白組相比，模型組、推拿組、灌胃組的NF-ΚBp65 mRNA 表達均上調，差異具有統計學意義（P＜0.05），推拿加灌胃組與空白組相比NF-ΚBp65 mRNA 表達幾乎無差異，稍上調，差異無統計學意義（P>0.05）；與模型組相比，各治療組NF-ΚBp65 mRNA 表達下調，差異具有統計學意義（P＜0.05），各治療組NF-ΚBp65 mRNA 表達量：推拿加灌胃組＜推拿組＜灌胃組，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見表2、圖2。

圖1 各組大鼠滑膜組織TRAF6 mRNA 表達水平

圖2 各組大鼠滑膜組織NF-ΚBp65 mRNA 表達水平

表2 各組大鼠滑膜組織TRAF6、NF-ΚBp65 mRNA的表達水平（s，n=9）

表2 各組大鼠滑膜組織TRAF6、NF-ΚBp65 mRNA的表達水平（s，n=9）

注：與空白組比，*P＜0.05；與模型組比，#P＜0.05

2.4 各組滑膜TRAF6、NF-ΚBp65 蛋白的表達水平與空白組相比，其余各組TRAF6、NF-ΚBp65 蛋白的表達上調，差異具有統計學意義（P＜0.05）；與模型組相比，其余各組TRAF6、NF-ΚBp65 蛋白的表達下調，差異具有統計學意義（P＜0.05），各治療組TRAF6、NF-ΚBp65 蛋白表達：推拿加灌胃組＜推拿組＜灌胃組，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見表3、圖3。

小說《斗破蒼穹》，主人公蕭炎，從一開始的“廢柴”，到最后肩負起家族復興的重擔，并逐步走向大陸巔峰，成為天才的故事告訴我們一個令我們受益終生的道理，那就是：只有靠自己的努力奮斗的人，才有可能實現自己的理想！小說本身所體現的精神與內涵，是一個屬于不斷奮斗的歷史，是一段不斷前行的歷史。主人公有著絕強的性格，永不言敗的精神，一路闖蕩，一次又一次地創造不可思議的奇跡。

表3 各組大鼠滑膜組織TRAF6、NF-ΚBp65 蛋白的表達水平（s，n=9，μmol/L）

表3 各組大鼠滑膜組織TRAF6、NF-ΚBp65 蛋白的表達水平（s，n=9，μmol/L）

注：與空白組比，*P＜0.05；與模型組比，#P＜0.05

圖3 各組大鼠滑膜組織TRAF6、NF-ΚBp65 蛋白的表達水平（Western blotting）

3 討論

隨著對TLR4 研究的廣泛深入，OA 患者組織中的TLR4 受到的關注逐漸增多。TLR4 是TLRs 家族中的一員，作為一類I 型跨膜蛋白受體[15]，它的激活可誘導很強的免疫反應，在天然免疫和炎癥反應中發揮主要作用[16-17]。當TLR4 被激活后，TLR4 可以通過其下游的MyD88 依賴性信號轉導通路來激活各種炎癥因子。MyD88 是TLR4 信號通路中的關鍵接頭分子之一，主要作用是傳遞上游信息，在疾病的發生發展中產生重要作用[18]。當激活TLR4-MD2-CD14 復合體之后，TLR4 與MyD88 Toll 結構相結合，接著產生一連串級聯反應，再通過結合TRAF6 來激活IκB 激酶（IKK）復合體[19-20]。談冰[10]等研究發現新風膠囊通過下調NF-ΚBp65、TRAF6 的表達水平，降低異常的炎癥免疫反應，進而減輕膝骨性關節炎患者關節疼痛及僵硬癥狀。

腫瘤壞死因子受體相關因子6（TNF receptor associated factor 6，TRAF6）屬于TRAFs 家族，相對分子量為60 kD，由530 個氨基酸組成[21]。TRAF6 直接或間接參與許多條滑膜組織炎癥信號通路的活化過程，調控炎癥因子的產生和釋放，與破骨細胞的分化、存活及骨的重吸收等密切相關[22-23]。在炎癥反應、骨代謝、細胞凋亡及應激反應等方面具有重要意義[24-25]。由表2 和表3 的可以看出：與空白組相比，其余各組TRAF6 mRNA 和蛋白表達均上調，說明和正常大鼠對比，膝骨性關節炎大鼠滑膜中的TRAF6 mRNA 和蛋白含量均是高表達的，該因子與膝骨性關節炎的發生相關；與模型組相比，其余各組TRAF6 mRNA 和蛋白表達均下調，說明各治療組都能有效抑制了大鼠滑膜組織的TRAF6 表達，從而減輕炎癥反應。從圖1和圖3 可以看出：各治療組在與模型組相比TRAF6 mRNA 和蛋白表達均下調的同時，組間比較二者的表達也存在差異，且表達量都表現為：推拿加灌胃組＜推拿組＜灌胃組。這說明各治療組在有效抑制了大鼠滑膜組織的TRAF6 mRNA 和蛋白表達方面，推拿組優于灌胃組，但推拿加灌胃組的效果更好。

口腔專業研究生規范化培訓模式為理論課集中培訓、臨床見習和臨床實習。目前，國家規定的規范化培訓時間是3年，但有效的培訓時間并不充足。其原因主要為：整個培訓計劃、培訓內容和實施流程存在不足；碎片時間利用較差，因材施教的空間較少。以上因素導致了口腔專業研究生在規范化培訓中操作技能的有效培訓時間明顯減少，進而降低了規范化培訓的效率。

NF-κB 家族歸屬于Rel 蛋白家族，該家族共有5個成員，NF-κB1，NF-κB2、Rel A（p65）、Rel B 和c-Rel[26]，NF-κBp65 在炎癥反應、免疫調節、細胞凋亡及腫瘤發生中起到重要的作用[27-29]。由表2 和表3 可以看出：與空白組相比，其余各組NF-κBp65 mRNA 和蛋白表達上調，說明較正常大鼠來說，膝骨性關節炎大鼠滑膜中的NF-ΚBp65 mRNA 和蛋白含量均升高，該因子與膝骨性關節炎的發生相關；與模型相比，其余各組NF-ΚBp65 mRNA 和蛋白表達均下調，說明各治療組都能有效抑制了大鼠滑膜組織的NFΚBp65 表達，從而減輕炎癥反應。從圖2 和圖3 可以看出：各治療組在與模型組相比NF-κBp65 mRNA 和蛋白表達均下降的同時，組間比較二者的表達也存在差異，且表達量都表現為：推拿加灌胃組＜推拿組＜灌胃組，從而說明各治療組在有效抑制了大鼠滑膜組織的NF-κBp65 mRNA 和蛋白表達方面，推拿組優于灌胃組，但推拿加灌胃組效果更好。

推拿療法是醫者運用特定的手法作用于患者體表；可以通過刺激穴位或痛點，達到活血止痛、疏經通絡的作用[30]。一指禪推法為一指禪流派的經典治療手法，具有操作簡單，著力面積小，力量集中的特點，被廣泛用于科研及臨床[31]。胡炳麟[32]等研究發現一指禪推法能有效減輕膝關節骨性關節炎患者膝關節疼痛。本次實驗使用一指禪推法作用于大鼠血海、梁丘、內膝眼、外膝眼4 穴，再配合膝關節屈伸法，以達到舒筋骨、利關節的目的。

隨著高等教育的改革，地方師范院校培養中小學教師的使命被賦予了一種全新意義的綜合性人才培養基地的標識，向著更為全面的綜合性院校發展。教師資格證的統考和非師范院校的不斷增加，加之大學生就業的嚴峻性和就業渠道的多樣性，許多非師范生的學生選擇了教師職業，而師范院校的學生卻另辟蹊經，開創自己的求職創業之路。面對這種現狀，地方師范院校的人才培養模式及教師的課堂教學方法、手段都要不斷改革，既要凸顯“師范性”，又要兼顧學生職業變化的需求，要使學生具備終身發展的能力及素養。

綜上所述，推拿通過下調膝骨性關節炎大鼠滑膜組織TRAF-6、NF-ΚBp65 mRNA 和蛋白的表達，減輕滑膜炎癥反應，從而起到消炎止痛的作用，最終達到防治膝骨性關節炎的目的，這為推拿防治膝骨性關節炎的作用機制的臨床研究提供一定的實驗基礎。