黃芪對(duì)鉛損傷大鼠腦組織抗氧化能力影響的研究

尹曉婷，高偉超，李彥萱，張 珂，趙浩堂，周雅蕊，賴亞輝，孫維琦

（北華大學(xué)醫(yī)學(xué)院，吉林 吉林 132013）

鉛是一種高毒性重金屬，目前廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代工業(yè)生產(chǎn)。鉛被人體攝入后，以離子形式進(jìn)入血液循環(huán)，通過血腦屏障進(jìn)入腦[1]，臨床常見患者出現(xiàn)注意力障礙、記憶力喪失等癥狀[2]。鉛暴露對(duì)腦功能的影響還具有遠(yuǎn)期效應(yīng)，可以增加包括阿爾茲海默病在內(nèi)的多種神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病率[3]。鉛損傷中樞神經(jīng)系統(tǒng)的最主要機(jī)制究是氧化應(yīng)激損傷[4]，然而黃芪的藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)黃芪可以抗氧化改善學(xué)習(xí)記憶能力[5]。但關(guān)于黃芪抗鉛損傷的研究目前國內(nèi)還鮮有研究，因此本實(shí)驗(yàn)在建立大鼠鉛損傷的模型上進(jìn)行不同濃度黃芪抗鉛損傷的研究，為臨床鉛損傷造成的學(xué)習(xí)記憶力障礙臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 SD雄性大鼠40只，大鼠體質(zhì)量180～2 20 g，購于吉林大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，自由飲食、飲水。

1.1.2 藥品 黃芪顆粒黃芪顆粒（免煎型）由華潤(rùn)三九醫(yī)藥股份有限公司提供，每包1 g，相當(dāng)于生藥10 g，批號(hào)1103171S，GMP認(rèn)證。

1.1.3 試劑及儀器 考馬斯亮藍(lán)法蛋白定量測(cè)定試劑盒、丙二醛（MDA）測(cè)定試劑盒、總超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、一氧化氮（NO）測(cè)定試劑盒、膽堿酯酶（CHE）測(cè)試盒、谷胱甘肽過氧化無酶（GSH-Px）測(cè)試盒均購于南京建成生物工程研究所；醋酸鉛溶液1 g/L購于遼寧泉瑞試劑有限公司；TM-100 Morris水迷宮儀器（成都泰盟技術(shù)有限責(zé)任公司）；TAS-990AFG型原子吸收分光光度計(jì)（普析通用）。

1.2 方法

1.2.1 分組及給藥 將40只SD大鼠隨機(jī)分成5組，每組8只。分別為正常對(duì)照組、鉛損傷模型組、鉛損傷黃芪顆粒高、中、低劑量組。正常對(duì)照組大鼠自由據(jù)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，各組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃芪顆粒對(duì)鉛損傷大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響 定位航行實(shí)驗(yàn)中，鉛損傷模型組大鼠的平均逃避潛伏期、飲用蒸餾水；鉛損傷模型組、鉛損傷黃芪高、中、低劑量組自由飲用濃度為1 g/L的醋酸鉛溶液共4周，鉛損傷黃芪顆粒干預(yù)組按 3 g/kg、6 g/kg、12 g/kg 劑量，加入蒸餾水制備混懸液灌胃；正常對(duì)照組、鉛損傷模型組灌胃等容量生理鹽水。每6 d稱1次體質(zhì)量，調(diào)整灌胃量，1次/d，連續(xù)4周。

1.2.2 Morris水迷宮測(cè)試 時(shí)間為7 d （每日上午8：30—12：00）。該實(shí)驗(yàn)分為兩部分，1）定位航行實(shí)驗(yàn)：將小鼠置于水迷宮的房間適應(yīng)0.5 h，每只小鼠每天均訓(xùn)練1次，在平臺(tái)的對(duì)面，面向池壁將小鼠放入水中，記錄小鼠的逃避潛伏期；在120 s內(nèi)還未找到平臺(tái)，并記錄逃避潛伏期為60 s。最后都讓小鼠在平臺(tái)停留15 s。2）空間探索實(shí)驗(yàn)：訓(xùn)練第6天將平臺(tái)撤出，入水點(diǎn)不變，把小鼠放入水中120 s，測(cè)量目標(biāo)象限滯留時(shí)間、游泳路程及速度。

1.2.3 大鼠標(biāo)本處理 用嚙齒動(dòng)物專用斷頭器斷頭處死大鼠，取大腦制成10%的腦組織勻漿，在溫度4℃下，3500 r/min離心15 min，收集上清液待測(cè)。同時(shí)完成取右側(cè)股骨操作，將股骨上肉剔除干凈后剪成碎段放入帶有編號(hào)的小燒杯中備用。

1.2.4 指標(biāo)檢測(cè) 按照試劑盒步驟檢測(cè)大鼠腦中膽堿酯酶（CHE）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）、一氧化氮（NO）含量。 蛋白定量采用考馬斯亮藍(lán)法。原子吸收石墨爐法檢測(cè)骨鉛含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 通過SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，數(shù)運(yùn)動(dòng)距離長(zhǎng)于正常組（P＜0.05），鉛損傷模型組與黃芪顆粒劑量組大鼠的平均逃避潛伏期、運(yùn)動(dòng)距離對(duì)比，隨黃芪劑量增加而縮短（P＜0.05）；在空間探索實(shí)驗(yàn)中，鉛損模型組大鼠的滯留時(shí)間和穿越次數(shù)均少于正常組（P＜0.05），鉛損傷模型組與黃芪劑量組大鼠的滯留時(shí)間和穿越次數(shù)隨黃芪劑量增加而逐漸增多（P＜0.05）。結(jié)果見表1。

2.2 黃芪顆粒對(duì)鉛損傷大鼠腦組織中抗氧化能力的影響 模型組的MDA含量高于正常對(duì)照組MDA含量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），低、中、高劑量黃芪顆粒干預(yù)組與模型組對(duì)比MDA明顯降低，并隨劑量增加而明顯降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；模型組的SOD水平低于正常對(duì)照組SOD水平，模型組與正常對(duì)照組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），低、中、高劑量黃芪顆粒干預(yù)組與模型組對(duì)比SOD明顯增高，并隨劑量增加而明顯增加，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；模型組的CHE活力低于正常對(duì)照組CHE水平，造模組與正常對(duì)照組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），低、中、高劑量黃芪顆粒干預(yù)組與模型組對(duì)比CHE明顯增高，并隨劑量增加而明顯增加，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；正常對(duì)照組和模型組大鼠腦組織中GSH-Px相較，模型組明顯降低有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），造模組和黃芪顆粒低、中、高干預(yù)組對(duì)比沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；模型組NO含量高于其它4組NO含量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），低、中、高劑量黃芪顆粒干預(yù)組與模型組對(duì)比NO明顯降低，并隨劑量增加而明顯降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果見表2。

表1 黃芪對(duì)鉛損傷大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響（±s， n = 8）

表1 黃芪對(duì)鉛損傷大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響（±s， n = 8）

注：與正常對(duì)照組比較，# P＜0.05；與低劑量黃芪組比較，△P＜0.05；與中劑量黃芪組比較，▲P＜0.05；與高劑量黃芪組比較，□P＜0.05

組 別 定位航行實(shí)驗(yàn) 空間探索實(shí)驗(yàn)潛伏期/s 運(yùn)動(dòng)距離/m 滯留時(shí)間/s 穿越次數(shù)/次正常對(duì)照組 30.427±4.669 8.717±2.320 16.800±4.201 13.500±3.338黃芪低劑量組 39.721±4.520 11.465±5.240 10.871±2.621 11.714±3.251黃芪中劑量組 37.300±3.323 11.980±4.176 13.671±3.992 11.857±3.132黃芪高劑量組 34.725±6.091 9.361±2.019 16.713±3.392 13.875±1.885鉛損傷模型組 42.585±4.632#△▲□ 11.980±4.299#△▲□ 11.756±3.740#△▲□ 7.889±3.444#△▲□

表2 黃芪對(duì)鉛損傷大鼠大腦中MDA、SOD、CHE、GSH-Px、NO的影響（±s， n = 8）

表2 黃芪對(duì)鉛損傷大鼠大腦中MDA、SOD、CHE、GSH-Px、NO的影響（±s， n = 8）

注：與正常對(duì)照組比較，# P＜0.05；與低劑量黃芪組比較，△P＜0.05；與中劑量黃芪組比較，▲P＜0.05；與高劑量黃芪組比較，□P＜0.05

組 別 MDA/（nmol/mg） SOD/（U/mg） CHE/（U/mg） GSH-Px/（μmol/L） NO/（μmol/g）正常對(duì)照組 0.265±0.127 13.699±2.995 5.716±2.506 5.121±1.785 0.886±0.789黃芪劑量組 0.550±0.294 11.351±1.133 5.471±1.328 3.919±1.008 1.223±0.481黃芪中劑量組 0.421±0.381 11.277±2.045 4.323±1.192 3.571±1.722 1.065±0.642黃芪高劑量組 0.370±0.134 10.994±1.519 4.638±1.188 3.885±1.199 0.991±0.714鉛損傷模型組 0.665±0.395#△▲□ 10.609±2.069#△▲□ 5.630±3.088#△▲□ 3.656±0.704#△▲□ 2.135±1.014#△▲□

2.3 黃芪對(duì)鉛損傷大鼠骨鉛檢測(cè)結(jié)果 鉛損傷模型組的骨鉛含量顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.05），低、中、高劑量黃芪顆粒干預(yù)組與模型組對(duì)比骨鉛含量明顯下降，并隨劑量增加而明顯降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果見表3。

3 小結(jié)

黃芪是一味具有補(bǔ)氣益氣功效的中藥，《神農(nóng)本草經(jīng)》中記載：“黃芪，味甘，性微溫，歸肺、脾、肝、腎經(jīng)。”中醫(yī)認(rèn)為，黃芪具有補(bǔ)虛補(bǔ)陽、疏肝解郁、利尿消腫之功效。現(xiàn)代藥理學(xué)證明黃芪主要化學(xué)成分是黃芪多糖、黃芪皂苷、黃酮類、氨基酸、微量元素等，具有增強(qiáng)免疫系統(tǒng)功能、調(diào)節(jié)血壓、抗腫瘤、抗衰老等作用[6]。鉛是日常生活中常見的重金屬污染物,主要通過飲食攝入、皮膚接觸和氣體交換三個(gè)途徑進(jìn)入機(jī)體并蓄積，繼而在機(jī)體中產(chǎn)生毒性損傷。中樞神經(jīng)系統(tǒng)是機(jī)體鉛損傷最為敏感的主要靶器官之一，同樣也是受損最為嚴(yán)重的系統(tǒng)，損傷中樞神經(jīng)系統(tǒng)后臨床常見頑固性頭痛、精神遲鈍和注意力障礙、記憶力喪失等癥狀，兒童較成人更容易被損傷，臨床癥狀更加明顯[7]。

表3 各組大鼠骨鉛水平測(cè)定結(jié)果（±s ，n = 8）

表3 各組大鼠骨鉛水平測(cè)定結(jié)果（±s ，n = 8）

注：與正常對(duì)照組比較，# P＜0.05；與低劑量黃芪組比較，△P＜0.05；與中劑量黃芪組比較，▲P＜0.05；與高劑量黃芪組比較，□P＜0.05

組 別 骨鉛含量/（μg/g）正常對(duì)照組 13.469±4.029低劑量組 29.960±4.503中劑量組 24.267±6.155高劑量組 23.792±8.062鉛損傷模型組 42.116±12.389#△▲□

學(xué)習(xí)記憶障礙作為鉛損傷損傷后的常見的臨床癥狀，被醫(yī)學(xué)界廣泛研究與重視，Morris水迷宮是一種通過強(qiáng)迫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物游泳來學(xué)習(xí)尋找隱藏于水中的平臺(tái)的操作過程, 是目前世界公認(rèn)的較客觀的評(píng)價(jià)學(xué)習(xí)記憶功能方法[8]。本實(shí)驗(yàn)研究表明鉛損傷大鼠在黃芪顆粒的干預(yù)下定位航行和空間探索有明顯的改善，提高了大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。本研究還發(fā)現(xiàn)黃芪顆粒有促進(jìn)鉛在機(jī)體內(nèi)代謝的作用，大鼠體內(nèi)的骨鉛在黃芪顆粒干預(yù)下可明顯降低。

鉛在大腦中的氧化應(yīng)激損傷途徑主要包括兩個(gè)方面，一是使腦中氧自由基產(chǎn)量增多，另一個(gè)就是影響腦中的抗氧化過程[9]。抗氧化應(yīng)激包括酶抗氧化系統(tǒng)和非酶抗氧化系統(tǒng)兩大方面。SOD、CHE、GSH-Px是機(jī)體內(nèi)清除氧自由基的重要酶類，能夠使超氧化物陰離子轉(zhuǎn)變?yōu)镠O和氧分子，從而保護(hù)細(xì)胞膜，防止細(xì)胞破壞。鉛損傷大鼠大腦時(shí)引起SOD、CHE、GSHPx活性下降，大量氧自由基產(chǎn)生，導(dǎo)致腦組織損傷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)鉛損傷模型組SOD、CHE、GSH-Px活性明顯下降，鉛損傷下腦組織清除氧自由基的能力下降；通過黃芪顆粒干預(yù)后SOD、CHE活性明顯升高，表明黃芪顆粒能夠提高SOD、CHE的活性，清除氧自由基，但對(duì)GSH-Px活性影響不明顯。MDA是脂質(zhì)過氧化物的終產(chǎn)物，它能夠使細(xì)胞突變、衰老、死亡、生物膜變性或壞死。因此，檢測(cè)MDA含量能夠間接反應(yīng)細(xì)胞損傷的程度。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明鉛損傷模型組MDA含量明顯增加，經(jīng)黃芪顆粒干預(yù)后MDA含量明顯下降，提示黃芪顆粒能夠抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，保護(hù)腦組織。鉛蓄積影響一氧化氮合酶（NOS）的活力，催化產(chǎn)生NO，激發(fā)誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，引發(fā)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，影響學(xué)習(xí)記憶功能[10]，吳立蓉等通過研究黃芪對(duì)Ⅱ型糖尿病大鼠抗氧化能力的影響發(fā)現(xiàn)，黃芪可以增強(qiáng)糖尿病大鼠的抗氧化作用并抑制糖尿病大鼠血清NO/NOS水平[11]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明鉛損傷模型組NO含量明顯增加，經(jīng)黃芪顆粒干預(yù)后NO含量明顯下降，黃芪拮抗了鉛損傷造成的腦內(nèi)NO增高造成的氧化應(yīng)激，提高學(xué)習(xí)記憶能力。大量的研究發(fā)現(xiàn)黃芪在抗氧化應(yīng)激方面有多方面積極效應(yīng)，黃芪可以減輕自由基對(duì)腦細(xì)胞DNA的損傷，維護(hù)海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)完整性，改善或延遲腦組織和神經(jīng)元退行性變[12]，還可以通過減少Ros（reactive oxygen species）的釋放和激活抗氧化劑元素[13]，抑制氧化應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡[14]，恢復(fù)線粒體功能障礙和氧化應(yīng)激引起的形態(tài)學(xué)改變[15]。

綜上所述，黃芪顆粒對(duì)鉛損傷后大鼠腦組織中抗氧化作用有顯著影響，能明顯提高鉛損傷后大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，其機(jī)制可能是通過拮抗腦內(nèi)氧化應(yīng)激，具體拮抗途徑還有待于研究。雖然黃芪抗氧化作用的研究很多，但針對(duì)于黃芪拮抗鉛損傷的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)較少，希望本實(shí)驗(yàn)?zāi)転辄S芪拮抗鉛損傷作用提供有用的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。