季銨化鹵胺聚合物改性Fe3O4@SiO2納米粒子的制備及抗菌性能研究

肖凌寒, 李 娜, 卜聃琳

(1.長春工業大學 化學與生命科學學院， 吉林 長春 130012;2.長春工業大學 材料科學高等研究院， 吉林 長春 130012)

0 引 言

近年來，由病毒和細菌等微生物引起的健康問題頻頻出現，引起了人們的重視，研發新型、高效、無二次污染的抗菌材料成為當今研究熱點之一[1-2]。

鹵胺抗菌材料因其抗菌效果優異、穩定性高、無毒、廉價、可再生等特點，廣泛用于醫療領域、食品包裝、水凈化系統等方面。鹵胺化合物經過水解，N-Cl鍵轉變成N-H鍵，釋放出的Cl+具有強氧化性，可以破壞細胞基質，從而起到抗菌作用[3-4]。隨后，將其用消毒水(有效成分為NaClO)進行氯化處理，N-H鍵又轉變成N-Cl鍵，具有抗菌可再生性。對于鹵胺化合物而言，其與細菌相接觸的面積對抗菌效果起至關重要的作用。磁性納米粒子因其具有小尺寸、較大比表面積、無毒、可進行磁性回收等特點，廣泛用于抗菌納米復合材料的制備當中[5-6]。

季銨鹽類抗菌劑，尤其是高分子季銨鹽帶有豐富的正電荷，可以與帶負電荷的細菌相互作用，并破壞細胞質膜，導致滲透，從而起到抗菌作用。高分子季銨鹽因具有廣譜、耐熱性好、毒性低等優點，已成為抗菌領域的研究熱點[7-8]。

本研究引入了聚乙烯亞胺(PEI)，其富含活性較高的氨基，將其接枝到Fe3O4@SiO2納米粒子表面，并將本研究中合成的3-溴丙基-5,5-二甲基海因接枝到改性納米粒子表面，將PEI季銨化，經過氯化處理得到季銨化鹵胺聚合物改性Fe3O4@SiO2納米粒子，成功地制備了一種協同季銨鹽和鹵胺抗菌機理的可回收的抗菌納米復合材料。對氯化前后樣品進行抗菌測試，探究其抗菌性能及抗菌機理。

1 實驗部分

1.1 材料與設備

5，5-二甲基海因(98%)、1,3-二溴丙烷(99%)、硅酸四乙酯(>99%，GC)、γ-縮水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷(97%)、聚乙烯亞胺(M=70 000)，上海麥克林生物生化科技有限公司；

氨水(25 wt%～28 wt%)、三氯化鐵(99%)、碳酸鉀、氫氧化鉀，天津光復精細化工研究所；

乙二醇(AR)、無水乙酸鈉、檸檬酸鈉、甲醇(AR)、無水乙醇(AR)、次氯酸鈉(AR)，北京化工廠。

核磁共振波譜儀，瑞士布魯克公司1H-NMR，AV-400；

透射電子顯微鏡(TEM),日本電子JEM-2000EX；

傅里葉變換紅外光譜儀(FT-IR),美國賽默飛世爾公司Thermo Fisher IS50；

Zeta電位分析儀,美國布魯克海文儀器公司 90Plus Zeta；

振動樣品磁強計(VSM),中國上海懿宏科學儀器有限公司Lake Shore 7404。

1.2 實驗方法

1.2.1 3-溴丙基-5,5-二甲基海因的合成

按照文獻[9]合成3-溴丙基-5,5-二甲基海因(BHD)，將3.2 g 5,5-二甲基海因(DMH，25 mmol)溶于120 mL丙酮當中，加入10 g無水碳酸鉀(75 mmol)，冷凝回流1 h，再加入2.8 mL 1,3-二溴丙烷(27 mmol)，反應70 ℃回流12 h。待反應結束冷卻至室溫后，進行抽濾除去未反應的碳酸鉀，收集濾液進行減壓蒸餾而得到白色固體粗產品，再用柱層析法將該固體進行提純(乙醇/環己烷=1/2-1/1)，最終得到白色固體即為目標化合物，產率為80%。1H-NMR(CDCl3,400 MHz)：δ(×10-6)= 5.93(s，1H)，3.64(t,J=6.9 Hz,2H)，3.39(t，J=6.7 Hz)，2.22(m，2H)，1.43(s，6H)。

1.2.2 環氧官能團修飾的Fe3O4@SiO2納米粒子的制備

首先通過改進的水熱法制備Fe3O4納米粒子[10]。將1.08 g三氯化鐵溶于20 mL乙二醇中，攪拌0.5 h后加入1.8 g無水乙酸鈉再繼續攪拌1 h，溶液變成澄清黃色，繼續向上述反應加入0.25 g檸檬酸鈉，待其形成均相分散液，轉移至聚四氟乙烯反應釜中，200 ℃反應10 h。在外加磁場下將磁性納米粒子分離出來，用去離子水和乙醇沖洗后離心，重復幾次，放入60 ℃真空烘箱中干燥。

通過溶膠-凝膠法制備Fe3O4@SiO2納米粒子[11]。取0.2 g新制備的Fe3O4納米粒子，20 mL蒸餾水，80 mL乙醇，2 mL氨水置于250 mL的三口圓底燒瓶中，機械攪拌30 min，將5 mL硅酸四乙酯加入20 mL乙醇中，然后將混合液逐滴滴加到上述反應中，繼續室溫攪拌12 h。待反應結束，磁性分離出Fe3O4@SiO2納米粒子，用去離子水和乙醇沖洗并離心，重復幾次，真空干燥。

將0.5 g Fe3O4@SiO2加到0.1 mL γ-縮水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷(KH560)和40 mL乙醇的混合液當中，40 ℃回流12 h。用去離子水和乙醇沖洗幾次除去未反應的KH560，放入真空烘箱中干燥，記為Fe3O4@SiO2-KH560。

1.2.3 季銨化鹵胺聚合物改性Fe3O4@SiO2納米粒子的制備

將一定量Fe3O4@SiO2-KH560分散到甲醇當中，按照質量比4∶1加入聚乙烯亞胺(PEI)，于3 ℃反應7 h。改性納米粒子表面的環氧官能團與PEI上的伯氨和仲胺基發生開環反應，這個過程就是PEI的叔胺化過程。反應結束，用水和乙醇進行沖洗，多反復幾次，再真空烘干，得到Fe3O4@SiO2-PEI納米粒子。

稱取0.1 g BHD固體，將其溶于50 mL甲醇當中，待升溫至60 ℃再加入0.5 g Fe3O4@SiO2-PEI納米粒子，繼續反應24 h。在這個反應過程中，BHD與納米粒子表面PEI的叔胺位進行取代反應，即為PEI的季銨化過程。待反應結束后，用去離子水和乙醇沖洗，放入真空烘箱干燥一夜，得到Fe3O4@SiO2-QPEI納米粒子。

將0.5 g Fe3O4@SiO2-QPEI加入30 mL次氯酸鈉溶液(30 wt%)中，機械攪拌12 h，用水和乙醇沖洗3次，60 ℃真空干燥一夜得到季銨化鹵胺聚合物改性納米粒子，記為Fe3O4@SiO2-QPC。

1.3 有效氯含量的測定

按照硫代硫酸鈉-碘量法滴定，測得有效氯的含量[12]。取一定量Fe3O4@SiO2-QPC抗菌納米粒子于錐形瓶中，加入一定量去離子水、碘化鉀以及淀粉溶液。KI中I-會被納米粒子表面Cl+還原成I2，此時溶液顯藍色。用已知濃度的硫代硫酸鈉標準溶液去滴定上述溶液，其有還原性，會將I2還原成I-，藍色消失即達到滴定終點。重復3次，進行平行滴定。

有效氯的含量

(1)

式中：N----滴定所消耗的硫代硫酸鈉的當量濃度,N；

V----滴定所消耗的硫代硫酸鈉的體積,L；

W----滴定所使用樣品的質量,g。

1.4 抗菌性能測試

選用金黃色葡萄球菌(ATCC 25923)和大腸桿菌(ATCC25922)作為指示菌，用最小抑菌濃度法對粉末樣品進行抗菌性能的表征。先把樣品進行滅菌處理，然后將其配制成一系列的不同梯度的濃度，再把已知濃度的樣品倒至一定量濃度的菌液之中，以37 ℃進行恒溫震蕩培養，通過觀察其渾濁度的變化來判斷細菌是否增殖，當不出現增殖現象的時候，所使用的濃度就是樣品的最小抑菌濃度。

2 結果與討論

2.1 結構分析

BHD的1H-NMR譜圖如圖1所示。

圖1 BHD的1H-NMR譜圖

由圖1可以看出，5.93×10-6處為海因環N-H上的氫原子，3.64×10-6和3.39×10-6處為烷基取代鏈上靠近海因環一側和靠近Br一側-CH2-上的氫原子，2.22×10-6處為烷基鏈最中間-CH2-上的氫原子，1.43×10-6處為海因環兩個-CH3上的氫原子。該1H-NMR譜圖中的化學位移、峰面積以及峰型都吻合BHD的化學結構。說明了目標化合物3-溴丙基-5,5-二甲基海因的成功制備。

2.2 TEM分析

對Fe3O4、Fe3O4@SiO2和Fe3O4@SiO2-QPC納米粒子進行形貌分析，其透射電子顯微鏡圖片如圖2所示。

(a) Fe3O4

(b) Fe3O4@SiO2

(c) Fe3O4@SiO2-QPC圖2 TEM圖片

由圖2(a)可以看出，Fe3O4出現團聚現象，直徑約為96 nm。圖2(b)中能夠明顯看出，Fe3O4@SiO2具有核殼結構，SiO2殼成功地包覆在Fe3O4核的表面，該納米粒子分散均勻，粒徑大小相對均勻，直徑約為125 nm，外部SiO2殼層厚度約為14.5 nm。圖2(c)可知，Fe3O4@SiO2-QPC直徑約為153 nm，其殼外表面粗糙，為聚合物殼層，厚度約為9 nm。

2.3 FT-IR分析

對樣品進行了紅外測試，采用溴化鉀壓片法，KBr為光譜純，結果如圖3所示。

圖3 Fe3O4、Fe3O4@SiO2、Fe3O4@SiO2-QPEI和Fe3O4@SiO2-QPC的FT-IR譜圖

由圖3曲線a可以看出，在589 cm-1處是Fe-O的特征吸收峰。曲線b可以看出，除了有Fe-O 特征吸收峰之外，還多出現了3個強峰，在1 100 cm-1和840 cm-1處歸屬于Si-O-Si鍵的對稱和不對稱伸縮振動吸收峰，而在950 cm-1處是Si-OH的伸縮振動峰。這個結果表明SiO2殼層成功地包覆在核Fe3O4納米粒子的表面。曲線c可以看出，除了以上特征吸收峰外，在1 700 cm-1處出現一個峰，這個峰是海因環上C=O的特征吸收峰。這個結果表明BHD成功地接枝到了Fe3O4@SiO2-PEI表面。曲線d可以看出，Fe3O4@SiO2-QPC的FT-IR譜圖上，由于氯化作用N-H轉變為N-Cl，破壞了原來的N-H…O-C氫鍵，原來1 700 cm-1處的C=O偏移到了1 680 cm-1，此結果與文獻報道相一致[13]。紅外分析結果說明，成功制備了季銨化鹵胺聚合物改性Fe3O4@SiO2抗菌納米粒子。

2.4 Zeta電位分析

用Zeta電位分析儀測試了樣品的Zeta電位，結果如圖4所示。

圖4 Fe3O4@SiO2、Fe3O4@SiO2-PEI和Fe3O4@SiO2-QPC的Zeta電位

由圖4可以看出，Fe3O4@SiO2的Zeta電位是-22.31 mV，這是由于SiO2表面富含羥基，在水溶液中呈現負電性，測試結果與其相符。Fe3O4@SiO2-PEI的Zeta電位為+30.12 mV，因為Fe3O4@SiO2經過PEI修飾表面富含氨基，在水溶液呈正電性，測試結果與之相吻合。而Fe3O4@SiO2-QPC的Zeta電位為+38.95 mV，這是因為將納米粒子季銨化之后，季氮原子呈正性，材料表面正電荷增多。電位分析結果也說明了本研究中季銨化鹵胺聚合物改性Fe3O4@SiO2納米粒子的成功制備。

2.5 磁性能分析

在室溫下測試樣品的磁性能，磁滯回曲線如圖5所示。

圖5 Fe3O4、Fe3O4@SiO2和Fe3O4@SiO2-QPC(c)的磁滯回曲線

圖5中，右下角插圖為樣品分散在水中，能用磁鐵快速回收的圖片。

Fe3O4、Fe3O4@SiO2和Fe3O4@SiO2-QPC的飽和磁化強度分別為73.9、32.4、25.7 emu/g，包覆殼層之后使得樣品的磁化強度減弱。從圖5可以看出，磁滯回曲線經過原點呈現出標準的S形，剩磁幾乎為0，即樣品在外加磁場消失之后磁性也消失，說明樣品具有超順磁性。這在磁分離以及再分散方面有著極大的優勢，如圖5中右下角的插圖所示。將一定量季銨化鹵胺聚合物改性Fe3O4@SiO2納米粒子分散于水中，使用磁鐵施加外加磁場，納米粒子迅速向磁鐵方向移動，20 s就能實現全部回收。并且在撤銷磁鐵之后，搖晃瓶子，樣品又能夠快速又均勻地重新分散在水之中。

2.6 抗菌性能分析

抗菌實驗以氯化前后的樣品Fe3O4@SiO2-QPEI和Fe3O4@SiO2-QPC作為對照實驗，最小抑菌濃度法的結果見表1。

表1 最小抑菌濃度法對樣品進行抗菌測試的結果

未經氯化的樣品Fe3O4@SiO2-QPEI對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的最小抑菌濃度分別為256 μg/mL和512 μg/mL。經過氯化作用之后的樣品Fe3O4@SiO2-QPC對葡萄球菌和大腸桿菌最小抑菌濃度分別為32 μg/mL和64 μg/mL。氯化之后的樣品比未氯化的樣品的最小抑菌濃度要低，說明氯化之后抗菌效果要好。

為了進一步考察樣品的抗菌效果，又對氯化前后的樣品Fe3O4@SiO2-QPEI和Fe3O4@SiO2-QPC進行了抗菌動力學實驗，結果見表2。

表2 對樣品進行抗菌動力學測試的結果

注：a為細菌濃度7.61×105CFU/樣品； b為細菌濃度1.02×106CFU/樣品。

未氯化的樣品Fe3O4@SiO2-QPEI在30 min內對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的對數減少值都有所降低，這是由于Fe3O4@SiO2-QPEI抗菌是由納米粒子表面季銨鹽的季氮原子起作用，其帶正電荷，而細菌表面帶負電荷，抗菌納米粒子會吸附到細菌的表面，與其接觸，使蛋白質變性或者破壞細胞膜的結構，從而達到抗菌的作用。氯化之后的樣品Fe3O4@SiO2-QPC能夠在30 min內殺死100%的兩種細菌，其抗菌是協同季銨鹽抗菌及N-鹵胺抗菌機理，在季氮原子正電荷起作用的同時，N-鹵胺中N-Cl鍵水解，釋放出的Cl+具有強氧化作用，可破壞細胞膜結構,從而導致細胞失活。由表2還可以看出，二者對金黃色葡萄球菌的抗菌效果都比大腸桿菌好。這是由于大腸桿菌是典型的革蘭氏陰性菌，與革蘭氏陽性菌黃色葡萄球菌相比，除了有一層細胞壁之外，還有一層細胞外膜，不利于抗菌劑向細胞壁接近，所以，季銨化鹵胺聚合物改性Fe3O4@SiO2納米粒子對革蘭氏陽性菌的抗菌效果要優于革蘭氏陰性菌。

3 結 語

本實驗成功制備了Fe3O4@SiO2-QPC納米粒子，1H-NMR表明了小分子BHD的成功合成，利用FT-IR和TEM對樣品進行結構和形貌表征，表明聚合物成功接枝在Fe3O4@SiO2表面，納米粒子有明顯的核殼結構。通過磁性測試證明了樣品可以通過外加磁場實現回收，可對樣品重新氯化反復使用。以金黃色葡萄球菌和大腸桿菌作為指示菌進行抗菌測試，結果表明，Fe3O4@SiO2-QPC納米粒子能夠協同季銨鹽及鹵胺抗菌機理，30 min內能使全部細菌失去活性，比未氯化樣品Fe3O4@SiO2-QPEI抗菌效果好。