CDK4/6抑制劑palbociclib專利技術分析

蔣薇薇

(國家知識產權局專利局專利審查協作江蘇中心，江蘇 蘇州 215163)

細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK) 是一類絲氨酸/蘇氨酸激酶，其和細胞蛋白在細胞周期調控中的重要作用，是諾貝爾生理學醫學獎獲得者在20 世紀70 年代后，經研究才得以發現[1]。CDK作為細胞內重要的信號轉導分子，和細胞周期蛋白形成CDK-cyclin復合物，參與細胞的生長、增殖、休眠或者進入凋亡。CDK家族包括CDK 1～13，cyclin分為cyclin A-L，CDK的不同成員分別與不同的cyclin結合，形成不同的活性復合物，促進細胞周期的轉變，調控細胞的轉錄，以及啟動DNA的合成[2-3]。其中，cyclin D家族，在G1期開始表達，結合并激活CDK4和CDK6，形成CDK4/6-Cyclin D復合物，使包括視網膜母細胞瘤蛋白在內的一系列底物磷酸化。Rb被磷酸化后可促進細胞增殖，使細胞周期由G1期向S1期轉變。而CDK 4/6抑制劑能夠特異性地和cyclin D1結合形成復合物，將細胞周期阻滯于G1期，阻止細胞從G1期進入S期，從而起到抑制腫瘤增殖的作用[4-5]，CDK4/6因此成為抗腫瘤的靶點之一。

目前，經科研工作們的不懈努力，一些著名醫藥公司陸續報道了一系列選擇性較好的CDK4/6抑制劑，主要包括：PD0332991(palbociclib)、LY2835219(abemaciclib)、LEE-011(ribociclib)和P276-00[6-8]。其中，僅palbociclib于2015 年2 月3 日作為乳腺癌治療藥物在美國上市，其余均處于臨床研究階段。

1 Palbociclib的基本概況

Palbociclib(帕博西林、帕博昔里布，結構式見圖1)，化學名：6-乙酰基-8-環戊基-5-甲基-2-[[5-(哌嗪-1-基) 吡啶-2-基]氨基]吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮，CAS登記號：571190-30-2，是輝瑞公司(Pfizer)原研開發的全新抗腫瘤藥物，其作為目前唯一一個已經上市的CDK4/6選擇性抑制劑，用于治療雌激素受體陽性和人表皮生長因子受體2 陰性晚期乳腺癌，商品名Ibrance。

圖1 palbociclib的化學結構式

本文就近年來關于palbociclib的專利申請作技術綜述，通過在中文數據庫CNABS、外文數據庫VEN(由SIPOABS和DWPI組成)兩個專利數據庫中檢索獲得進行統計分析的專利樣本，檢索日期截至2018年12月30日，經過數據整理，得到相關專利文獻340余篇。根據上述樣本，獲得近十幾年國內外相關專利申請年度分布如圖2所示。

圖2 相關專利申請年度分布情況

由圖2可見，2003年以前palbociclib的相關專利申請量為0，2003～2010年專利申請數量較少，從2011年開始palbociclib相關專利申請量才有所增加，并從2014年開始迅速增長。這和palbociclib研發歷程和上市發展趨勢十分一致，雖然palbociclib項目于1995年就被發起，但其于2001年才合成得到，palbociclib的I期試驗于2004年開始進行，但當時實驗結果表明該藥物并沒有在I期試驗中顯示出明顯的抗腫瘤效應，當時外界普遍不太看好該藥物，這也正對應了自2004年之后幾年內palbociclib的相關專利申請量并沒有呈現明顯增長的趨勢。

2 Palbociclib相關專利技術發展路線

自2003年原始專利WO2003062236首次公開palbociclib之后，人們圍繞該藥物進行了一系列后續研究，主要包括化合物的新晶型、氘代形式，化合物的制備方法及中間體，衍生物，藥物組合物，聯合用藥以及化合物制備方法等幾個方面，形成了完整的專利保護鏈。以下分5個方面進行詳細介紹。

2.1 化合物、其鹽及晶型 Palbociclib的化合物專利最早是由Warner-Lambert公司(后被輝瑞公司并購，之后palbociclib的化合物專利就屬于輝瑞公司)在2003年01月10日申請(WO2003062236)，該專利中具體要求保護了化合物6-乙酰基-8-環戊基-5-甲基-2-[[5-(哌嗪-1-基) 吡啶-2-基]氨基]吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮，即palbociclib，以及包含該化合物的通式化合物、藥物組合物及其制備治療CDK介導疾病藥物中的用途。

化合物的晶型專利是延長化合物專利保護期的有效衍生專利，輝瑞公司于2014年02月08日在國際專利申請WO2014128588中申請保護一種固態形式的palbociclib，包括A型結晶和B型結晶，其中A型為更穩定的晶型。

印度的Sun Pharmaceutical IND公司在WO2016024249中公開了palbociclib的Form Ⅰ、Form Ⅱ、Form Ⅲ、 Form Ⅳ、Form Ⅴ、Form Ⅴ-A、 Form Ⅵ、Form Ⅶ以及Form Ⅷ 9種晶型。

歐洲的SANDOZ AG公司在國際專利申請WO2016066420中公開了一種palbociclib的單鹽酸鹽晶體。

天津華洛康生生物科技有限公司于CN105085517中公開了一種palbociclib的新晶體：Form I，該晶型相對于WO2014128588中的晶型A和晶型B具有良好儲存穩定性，同時在水中和極性溶劑中的溶解度比晶型A和晶型B有明顯提高。

此外，為了繞開palbociclib的化合物專利，許多公司也對palbociclib化合物進行了一定的衍生化，如氘代物或鹽。Palbociclib的原研公司Warner-Lambert在WO2005005426中針對palbociclib本身存在的水溶性差導致生物利用度較低的缺陷，發明了一種palbociclib的羥乙基磺酸鹽，并具體公開了其A、B和D 3種多晶型形式。

鄭州泰基鴻諾藥物科技有限公司在CN104447739中公開了如圖3所示的幾種氘代palbociclib衍生物，該發明通過對palbociclib的選擇性氘代，改善了藥物的藥代性質，進而提高了藥物的療效、安全性和耐受性。

2.2 制備方法及中間體 Palbociclib的制備方法最早公開于輝瑞公司的國際專利申請WO2008032157中，該路線以N-Boc保護的哌嗪s-1和2-硝基-5-溴-吡啶s-2為起始原料，經過親核芳香取代反應，隨后在Pd/C氫作用下將硝基還原為氨基得s-4；嘧啶化合物s-5和環戊基胺經過親核芳香取代反應、Heck反應，隨后在醋酸酐催在下脫水縮合成環，進一步溴代得s-8；s-4和s-8通過SNAr反應得到化合物s-9，再和烯基醚通過Heck反應，最后在羥乙磺酸作用下，脫Boc保護基，將烯基醚片段水解至酮以及成鹽得到最終的palbociclib，具體如圖4所示。

圖4 palbociclib的最早專利合成路線

由于上述專利路線主要涉及8步反應，路線較長，總收率低，操作煩瑣，原料本身成本較高，此外，該制備工藝中還多次用到了對環境不友好的強腐蝕性的溴素試劑，因而這條合成路線工業化生產難以實現。為此，輝瑞公司在WO2014128588中對原路線進行了一定的改進，主要是將脫保護與成鹽步驟改為一鍋法完成，并且在氨基吡啶與嘧啶的親核取代反應中使用強堿氨基鋰或異丙基氯化鎂，使得總收率提高到43.55%。雖然該方法有所改進，但原合成路線中存在的多個缺陷并未得到實質性的克服。

為了克服上述種種缺陷，科研工作者們主要都是以輝瑞的WO2008032157為基礎，對其工藝進行改進以期提供一種集經濟、環保、簡便等特點于一體的全新palbociclib后續合成路線。結合palbociclib的結構特征，并對WO2008032157中的合成路線進行分析，可見，palbociclib的合成主要體現在母核的形成，取代基甲酰基、環戊烷基以及側鏈〔5-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基〕氨基的引入這4個方面。因而筆者在此基礎上對原專利申請以及此后報道的palbociclib制備路線進行歸納，將其主要分為以下5種類型。

2.2.1 以嘧啶類化合物為起始原料，首先引入環戊基，其次形成母核，再引入〔5-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基〕氨基，最后引入甲酰基，其代表性的palbociclib合成路線如圖4所示，代表性專利申請如輝瑞公司的WO2008032157和WO2014128588，以及歐洲RATIOPHARM GMBH公司的WO2016030439。

2.2.2 以嘧啶類化合物為起始原料，首先引入甲酰基，其次引入環戊基，再形成母核，最后引入〔5-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基〕氨基，其代表性的palbociclib合成路線如圖5所示，代表性專利申請如新發藥業有限公司的CN104610254。

圖5 第一種類型代表性的palbociclib合成路線

2.2.3 以嘧啶類化合物為起始原料，首先引入環戊基、其次引入甲酰基，再形成母核、最后引入側鏈〔5-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基〕氨基，其代表性的palbociclib合成路線如圖6所示，代表性專利申請如上海百奇醫藥科技的CN104910149。

圖6 第一種類型代表性的palbociclib合成路線

圖7 第三種類型代表性的palbociclib合成路線

2.2.5 以嘧啶類化合物為起始原料，與含有甲酰基的化合物反應，首先形成帶有甲酰基的母核，再引入環戊基，最后引入側鏈〔5-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基〕氨基，其代表性的palbociclib合成路線如圖8所示，代表性專利申請如蘇州明銳醫藥科技有限公司的CN104496983A和WO2016082605，江蘇中邦制藥的CN105153149。

圖8 第四種類型代表性的palbociclib合成路線

除上述概括的典型反應之外，一些研究者們還將目光轉入到側鏈的改進上，如蘇州明銳醫藥科技有限公司的CN104447743A和WO2016082604，山東羅欣的CN105111205，新發藥業有限公司的CN104478874和CN104447743，其在引入側鏈的同時形成母環結構，大大縮減了工藝步驟，其合成路線示例如圖9所示。

圖9 引入側鏈時成環的palbociclib合成路線

通過對palbociclib相關合成路線的梳理，可見，上述改進后的制備方法均較少使用貴金屬鈀以及較貴的配體，并減少了相應步驟，同時原料也更為價廉易得。并且，對于palbociclib的制備工藝以及制備中間體的專利申請主要集中在中國。如蘇州明銳醫藥科技有限公司、新發藥業有限公司、上海博氏醫藥科技有限公司、山東羅欣藥業集團股份有限公司、北京修正創新藥物研究院有限公司等，這也體現了我國在palbociclib原料藥生產上的技術優勢以及作為主要原料生產國的地位。當然，隨著技術的進步和國內外企業研發熱情的高漲，相信會有越來越多關于palbociclib的合成工藝被開發出來，進而會有更多原料便宜、過程簡略、工藝條件簡單的制備方法被應用到工業化生產中，以便能夠廉價的生產出大量的palbociclib供市場所需。

2.3 藥物組合物及制劑 Palbociclib為難溶性物質，在水中溶解度約9 μg·mL-1，不溶或幾乎不溶，這直接影響了該化合物在體內的吸收和生物利用度。為了提高其水溶性，采用現代制劑新技術將其制備成藥物新劑型或組合物，是目前專利申請中的常見方式，同時這也是一種快速而又經濟的研發途徑與專利申請策略。

江蘇豪森藥業集團有限公司在國際專利申請WO2016070833中利用固體分散技術將palbociclib制備成固體分散體，并進一步與崩解劑、稀釋劑、黏合劑、潤滑劑以及助流劑組合。經大量實驗后發現，該組合物能夠顯著的增加藥物的溶解度，增加藥物的吸收和改善藥物體內的生物利用度。該公司還在WO2016070834中提供了一種適合醫藥應用的palbociclib，該藥物制劑具有有益的溶出行為和好的穩定性。此外，國內的其他公司也公開了多種將palbociclib或其鹽與不同的藥物載體組合，進而制備成適應臨床應用的一般藥物制劑，如南京正大天晴的CN105213322。

東南大學在CN105457038中公開了可將palbociclib制備成一種速釋型藥物磷脂化合物，進而再將其與合適的組合制備成一種藥物組合物，該速釋型藥物磷脂化合物及其脂質體納米顆粒可用作液體制劑、固體制劑、半固體制劑、滅菌制劑和無菌制劑，毒性低，可用于各種腫瘤等疾病的高效治療。此外，該高校還在CN105288648中公開了可將palbociclib制備成一種親水性磷脂化合物，并可由此制備得到一種粒徑為10～1 000 nm的脂質體納米顆粒，該脂質體納米顆粒同樣可用作液體制劑、固體制劑、半固體制劑、滅菌制劑和無菌制劑，毒性低，可用于各種腫瘤等的高效治療。

上海魯源醫藥在CN104887641中采用泡騰和非泡騰兩種漂浮機理設計而成一種palbociclib胃漂浮片；北京康立生在CN104892604中制備得到了一種palbociclib緩釋制劑；美國佐尼奧尼制藥公司在WO2014121211中公開了可將包含palbociclib在內的一些低水溶性的抗腫瘤藥物制備成脂質體。

由上可知，在制劑新技術、新設備以及新輔料快速發展的現代，人們大力開發palbociclib新制劑的基礎上，對于palbociclib制劑的研究并未隨著新劑型的出現而消失，仍有大量傳統制劑被申請。然而不可否認的是，新制劑的種類相對較為豐富，涉及水溶性包合物、固體分散制劑、微球、納米粒、脂質體等。這也說明，palbociclib新制劑的發展越來越受到科研工作者的重視。雖然目前市場上銷售的palbociclib藥物制劑為口服膠囊制劑，其存在制劑技術水平低、服用順應性差、生物利用度低等缺點，但是隨著現代制劑新技術、新設備以及新輔料的快速發展，必將會有更多的palbociclib的新制劑突破實驗室研究，進而服務于臨床，并且隨著這些新劑型的產業化，開發palbociclib用于癌癥等其他新適應證的緩控釋制劑、靶向制劑等，也將具有極好的市場前景。

1.1.2 主要儀器 高壓蒸汽滅菌鍋（上海東亞容器01J2003－04）、超低溫冰箱（SANYO MDF－392）、冰箱 （Hair208K ／ANCINA）、制 冰 機 （SCOTSMAN DA24845－3）、PCR 擴增儀（德國 Eppendorf 5331）；高速低溫離心機（德國Eppendorf 5417R）、電泳儀（北京六一DYY－4C）、渦旋振蕩器（美國 Scientific Industries Vortex－Genie 2）、電子天平（賽多利斯Secura?）、凝膠成像系儀器（美國伯樂 Gel Doc 200）、超微量紫外可見分光光度計（北京普析TU－1810）。

2.4 新用途或藥物聯用 雖然palbociclib上市時適用于有雌激素受體(ER)-陽性，人表皮生長因子受體2(HER2)-陰性晚期乳癌絕經后婦女的治療。然而究其根本，palbociclib的作用機制在于其能高選擇性地作用于cyclinD/CDK，抑制CDK4和CDK6的活性，因此，抑制Rb蛋白的磷酸化而導致細胞周期的阻滯。由于幾乎所有腫瘤細胞都存在細胞周期的異常調控所導致的異常增殖，因此，已有研究將PD-0332991作為抗腫瘤藥物，單獨或聯合其他化療藥物，應用于乳腺癌、前列腺癌、淋巴瘤等的治療的臨床實驗。天津醫科大學總醫院在CN104758292中公開了一種PD-0332991在制備防治耐藥腫瘤藥物的用途，其運用細胞生物學和分子生物學方法，以及在人吉非替尼耐藥的裸鼠移植瘤模型的試驗證明，PD-0332991能有效抑制人吉非替尼耐藥肺癌細胞生長，誘導凋亡，調控細胞周期相關基因，引起腫瘤細胞周期停滯，誘導凋亡，因此，可以將PD-0332991作為有效成分，制備防治吉非替尼耐藥腫瘤藥物及防治耐藥腫瘤食品、保健品及化妝品。

美國的阿拉貢藥品公司在WO2014113260中，將雄激素受體調節劑與palbociclib聯用，用于治療前列腺癌和用于治療適合于使用雄激素受體調節劑治療的疾病或病癥。普萊希科公司在WO2013142427中將palbociclib與其他化合物聯用用于治療與Fms蛋白激酶及其任何突變體、Kit蛋白激酶及其任何突變體、Flt-3蛋白激酶等相關的疾病。

北卡羅來納大學查珀爾希爾分校在palbociclib新用途開發方面作出了杰出貢獻，其分別在國際申請WO2012068381、WO2010132725、WO2010051127、以及WO2010039997中公開了palbociclib的4種新用途。其一是向已暴露于局部缺血或有局部缺血的風險的個體給給予palbociclib，可保護細胞和或組織免受由于局部缺血的損傷；其二是向已暴露于或有風險暴露于DNA損傷的個體給予palbociclib，可保護健康細胞免受歸因于DNA損傷劑的損傷；其三是使用palbociclib來誘導CDK4/6依賴性細胞例如造血干細胞和/或造血祖細胞中的暫時靜止，通過在暴露于所述電離輻射之前、同時或之后用palbociclib治療可以實現在哺乳動物中的輻射防護；其四是使用palbociclib來誘導CDK4/6依賴性細胞例如造血干細胞和/或造血祖細胞中的暫時靜止，由此減輕或預防細胞毒性劑化合物在健康細胞中的效應。

由于藥物新用途是延長和拓展藥物專利有效性的重要手段，相信隨著分子生物學的進步和對于palbociclib作用機理研究的進一步深入，日后必定會有越來越多涉及palbociclib新用途的專利申請被提出來，進而使得palbociclib在藥物治療領域煥發出引人注目的新篇章。

2.5 結構改造 眾所周知，想要改良化合物的成藥特性，最直接的方式即是對其化學結構進行改造，從根本上改變其各項性質。Palbociclib為難溶性物質，導致其體內吸收差以及生物利用度低的缺點是本領域公認的事實，正因為此，科研工作者們才有動機以palbociclib為先導化合物，進而對其進行結構修飾與改造，以期得到性質更好的化合物。

在palbociclib結構改造方面，廣東東陽光藥業有限公司做了重大努力，其先后在WO2016008433、WO2016015597、WO2016015598、WO2016015604、WO2016015605等國際專利申請中公開了對palbociclib的結構改造，其中最為典型的是WO2016015597，該申請中涉及的改造位點即為側鏈5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基，經實驗證明其申請中通式結構內的部分化合物對CDK4、CDK6激酶均有較強的抑制作用，且化合物的體內代謝較好，有較好的吸收和暴露量，生物利用度較高。美國的Concert Pharmaceuticals Inc在WO2014150925中也公開了對palbociclib的結構修飾，該申請在對palbociclib環上的氫原子進行部分氘代的同時，還對其母環上的5-位甲基、6-乙酰基以及嗎啉環上的4位基團進行了結構修飾。

對涉及palbociclib結構修飾的申請進行梳理，筆者發現，目前涉及的palbociclib結構修飾，多集中于palbociclib本身具有的取代位點，如5-位甲基、6-乙酰基等。事實上，根據palbociclib的化學結構所示，其上可供修飾的位點眾多，對于開發與palbociclib結構類似的CDK4/6抑制劑而言，雖然采用本領域常見的常規基團對先導化合物進行改造能夠極大地豐富化合物的種類，并且其制備方法也可以參照現有技術進行，采用本領域常規的反應方法即可制得，然而基團改造后得到化合物的活性有待考證，并不是所有改造后的化合物均具有或者更好的抗腫瘤活性，其需要實驗的驗證。Palbociclib作為一個剛剛上市不久的新藥，其衍生物在后續的申請中必然會越來越多。

3 結語

從技術發展脈絡看，圍繞palbociclib進行的后續專利申請主要涉及新晶型、制備方法和工藝、藥物組合物、藥物制劑以及結構改造等，這與藥物研發的一般思路一致。對于化合物及其制備方法而言，盡管palbociclib的相關核心專利技術(如化合物專利、晶型專利等)還主要掌握在原研公司輝瑞公司手中，但我國企業的藥物研發能力逐漸成熟，同時擁有明顯的原料藥生產優勢，這點從關于palbociclib的制備方法專利主要集中在中文專利中也可以看出，因此隨著palbociclib化合物專利的到期，相信palbociclib的本土化趨勢將不斷加強。

對于palbociclib晶型而言，雖然已有多個藥企對此進行了研究，但筆者認為，目前已有晶型表現出來的性質并沒有好到沒有上升空間的程度，因而在palbociclib的后續開發中，國內企業可以朝著更加穩定的palbociclib晶型或者其溶劑合物晶型的方向進行，這樣不僅能夠擁有自主知識產權而且還能繞開包括原研公司在內的已有效專利保護的晶型產品。此外，化合物的無定形形式也是藥用化合物的常見的固體形態，一些藥物的無定形形態在外觀、溶解度、熔點、溶出度、穩定性、生物利用度、生物有效性等方面相對于晶型形式更具優勢，因而國內藥企還可以適當關注palbociclib的無定形形式，從這個方面入手可能會獲得具有自主知識產權的成藥性更好的palbociclib產品。

對于palbociclib的新制備方法，國內的一些企業已經開發了多種高效、綠色經濟的制備方法，但這些方法大多數還局限于在WO2008032157基礎上進行的基團引入或成環次序的改進，這些方法均為涉及基團本身的改變。事實上，我們可以打破傳統，從化合物的結構出發，并根據化合物逆合成原理來進行分析，不一定非要局限于基團的引入或者成環次序的先后，可以從形成基團或者母環本身的步驟進行，如蘇州明銳醫藥科技有限公司就突破常規，對側鏈〔5-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基〕氨基進行了改進，并以此為基礎來形成母環，這樣不僅大大縮減了工藝步驟還節約了大量的生產成本。

對于palbociclib的藥物組合物或制劑，目前開發的產品中基本上已涉及了藥物制劑中的主要新技術，即固體分散體制備技術、包合物制備技術、聚合物膠束以及脂質體與泡囊制備技術。采用上述制劑新技術即可制備得到多種多樣不同的藥物新劑型，然而目前提及的palbociclib藥物制劑僅為藥劑學領域多種劑型中的一部分，因此palbociclib藥物新劑型的開發還可以從口服定時釋藥系統、免疫納米球、磁性微球或納米粒、pH敏感的靶向制劑等幾個方面著手。

對于palbociclib與其他藥物的聯用，目前主要是將palbociclib與其他已經抗腫瘤藥物進行聯用，但實質上，藥物的聯用并不局限于相似藥理活性的藥物聯用，將不同藥理活性的兩種藥物進行聯用可能或取得預料不到的效果，因而在palbociclib的后續藥物聯用開發中，我們可以從更微觀的機理上分析，以開發出更多合適的聯用產品。

對于palbociclib的結構改造，根據palbociclib的結構分析可知，其上可供修飾的位點眾多，化合物眾多位點以及多個活性官能團的存在為科研工作者們提供了極大的化合物改造空間，并且除了不同位點和活性官能團的改造外，改造骨架環系結構中的不飽和位置也是本領域技術人員在尋找性質更好的抗腫瘤化合物的常規手段。

雖然，palbociclib未來十幾年仍在專利保護期內，但其驕人的光環將繼續吸引人們圍繞該化合物進行開發，新合成方法、衍生物、開發更多新劑型以及針對新適應證的藥物聯用成為該品種未來技術發展的方向；另外，研究表明，CDK4/6抑制劑有著特異的選擇性，不僅能區別常見的絲/蘇氨酸激酶，而且能區別其他類型的CDK，因而palbociclib作為最為典型的CDK4/6抑制劑未來在抗腫瘤領域必將會有很好的市場前景。